标准编号:	GB 5009.284-2021
中文名称:	食品安全国家标准 食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定
英文名称:	National food safety standard - Determination of vanillin, 3,4-Dimethoxybenzaldehyde, 3-Ethoxy-4-hydroxybenzaldehyde and Coumarin in foods
中标分类:	X04    基础标准与通用方法
行业分类:	GB    国家标准
发布机构:	中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局
发布日期:	2021-09-07
实施日期:	2022-3-7
标准状态:	valid
翻译语言:	英文
文件格式:	PDF
中文字符数:	17000 字
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Codeofchina.com is in charge of this English translation. In case of any doubt about the English translation, the Chinese original shall be considered authoritative. National food safety standard - Determination of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin in food 1 Scope This standard specifies the method for the determination of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin in food. This standard is applicable to the determination of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin in formula foods/ complementary foods for infants and young children, pastry, confection, milk and dairy products, beverage and wheat flour. Method I Liquid chromatographic method 2 Principle Add water to the sample and mix them up; extract the mixture in an ultrasonic way after adding acetonitril; separate it by liquid chromatography; detect by UV detector or diode array detector; and quantify them by the external standard method. 3 Reagents and materials Unless otherwise specified, analytically-pure reagents and Class-I water specified in GB/T 6682 are used for the purpose of this method. 3.1 Reagents and materials 3.1.1 Acetonitrile (CH3CN): chromatographically pure. 3.1.2 Methanoic acid (HCOOH): chromatographically pure. 3.1.3 Methanol (CH3OH): chromatographically pure. 3.1.4 Sodium chloride (NaCl). 3.1.5 Concentrated hydrochloric acid (HCl): 12mol/L. 3.1.6 Organic-phase microporous membrane: 0.45μm.   3.2 Preparation of reagents 3.2.1 0.1% formic acid-methanol solution: dissolve 1mL of formic acid in methanol and dilute to 1,000mL; freshly prepare before use. 3.2.2 Hydrochloric acid solution (1mol/L): pipette 8.33mL of concentrated hydrochloric acid, dissolve it in water and dilute the solution to 100mL; freshly prepare before use. 3.2.3 Methanol-water solution (4+1): mix methanol and water at a ratio of 4:1 (volume ratio). 3.2.4 0.5% formic acid solution: dissolve 5mL of formic acid in water and dilute to 1,000mL; freshly prepare before use. 3.3 Standard substance 3.3.1 Vanillin standard sample (C8H8O3, CAS No.: 121-33-5): purity ≥98%, or its standard sample certified by the state and issued with the reference material certificate. 3.3.2 Methyl vanillin standard sample (C9H10O3, CAS No.: 120-14-9): purity ≥98%, or its standard sample certified by the state and issued with the reference material certificate. 3.3.3 Ethyl vanillin standard sample (C9H10O3, CAS No.: 121-32-4): purity ≥98%, or its standard sample certified by the state and issued with the reference material certificate. 3.3.4 Cumarin standard sample (C9H6O2, CAS No.: 91-64-5): purity ≥97%, or its standard sample certified by the state and issued with the reference material certificate. 3.4 Preparation of standard solution 3.4.1 Standard stock solutions (1,000mg/L): accurately weigh out 10mg (accurate to 0.1mg) of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin respectively, place them in 10mL volumetric flasks respectively, dissolve to the scale with 0.1% formic acid-methanol solution, and mix them up. Transfer the solutions to a brown glass container and store at -18℃ away from light; use them within the storage period of 8 months. 3.4.2 Mixed intermediate standard solutions (10mg/L): pipette 1.00mL of the standard stock solutions (1,000mg/L) of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin respectively, pour them into 100mL volumetric flasks respectively, add 0.1% formic acid-methanol solution to the scale, and mix them up. Transfer the solutions to a brown glass container and store at -18℃ away from light; use them within the storage period of 3 months.   3.4.3 Mixed standard series working solutions: pipette 0.2mL, 1.0mL and 5.0mL of mixed intermediate standard solution (10mg/L) respectively into a 10mL volumetric flask, and pipette 0.2mL, 0.5mL and 1mL of standard stock solution (1,000mg/L) of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin respectively into a 10mL volumetric flask, add methanol-water solution to the scale and mix them up. The mixed standard series working solutions shall have concentrations of 0.2mg/L, 1.0mg/L, 5.0mg/L, 20.0mg/L, 50.0mg/L and 100.0mg/L respectively; freshly prepare before use. 4 Apparatuses 4.1 Liquid chromatograph: equipped with diode array detector or ultraviolet detector. 4.2 Balances: with sensitivity of 0.1mg and 0.01g, respectively. 4.3 Vortex mixer. 4.4 Centrifuge. 4.5 Nitrogen evaporator. 4.6 Ultrasonic generator. 5 Analytical steps 5.1 Sample preconditioning 5.1.1 Sample preparation Shake the liquid samples well; directly use the homogeneous semi-solid or powdery solid sample to extract the specimen (5.1.2); homogenize or crush evenly samples of other states. 5.1.2 Specimen extraction 5.1.2.1 Formula milk powder and complementary foods for infants and young children Weigh 1.00g of the sample, add 10mL of water and 480μL of hydrochloric acid solution, shake it with a vortex mixer for 1min; add 20mL of acetonitrile, shake it with a vortex mixer for 1min, apply ultrasonic extraction for 30min, then add 5g of sodium chloride, shake it with a vortex mixer for 2min, centrifuge it at 8,000r/min for 5min; take the supernatant into a glass test tube, blow it with nitrogen at 40℃ until it is nearly dry; accurately add 1.0mL of methanol-water solution to dissolve the residue; filter it through a 0.45μm microporous membrane, and be ready to test. 5.1.2.2 Pastry, confection, milk and dairy products and beverage Weigh 1.00g of the specimen, add 5mL of water (if it is gum-based confectione, add 10mL of water and dissolve it in a 50℃ water bath), shake it with a vortex mixer for 1min; add 20mL of acetonitrile, shake it with a vortex mixer for 1min, and apply ultrasonic extraction for 30min; add 5g of sodium chloride, shake it with a vortex mixer for 2min, centrifuge it at 8,000r/min for 5min (if the sample is high-fat pastry, apply freezing centrifugation at 8,000r/min); take the supernatant into a glass test tube, blow it with nitrogen at 40℃ until it is nearly dry; accurately add 1.0mL of methanol-water solution to dissolve the residue; filter it through a 0.45μm microporous membrane, and be ready to test.

1 Scope Method I Liquid chromatographic method 2 Principle 3 Reagents and materials 4 Apparatuses 5 Analytical steps 6 Calculation (expression) of analytic result 7 Precision 8 Miscellaneous Method II Liquid chromatography-mass spectrography (LC-MS)/ Mass spectrometry (MS) 9 Principle 10 Reagents and materials 11 Apparatuses 12 Analytical steps 13 Calculation (expression) of analytic result 14 Precision 15 Miscellaneous Method III Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MC) 16 Principle 17 Reagents and materials 18 Apparatuses 19 Analytical steps 20 Calculation (expression) of analytic result 21 Precision 22 Miscellaneous Annex A Liquid chromatograms of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin Annex B GC-MS/MS characteristic ion chromatograms of the four compounds with corresponding deuteration isotope internal standard solutions Annex C GC-MS/MS characteristic ion scanning chromatograms and mass spectrograms of the four compounds with corresponding deuteration isotope internal standard solutions

食品安全国家标准 食品中香兰素、甲基香兰素、 乙基香兰素和香豆素的测定 1 范围 本标准规定了食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定方法。 本标准适用于婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、糕点、糖果、乳及乳制品、饮料、小麦粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定。 第一法 液相色谱法 2 原理 试样加水混匀后，加入乙腈超声提取，经液相色谱分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量。 3 试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB／T 6682规定的一级水。 3.1 试剂与材料 3.1.1 乙腈(CH3CN)：色谱纯。 3.1.2 甲酸(HCOOH)：色谱纯。 3.1.3 甲醇(CH3OH)：色谱纯。 3.1.4 氯化钠(NaCl)。 3.1.5 浓盐酸(HCl)：12 mol／L。 3.1.6 微孔滤膜：0.45μm，有机相型。 3.2 试剂配制 3.2.1 0.1％甲酸甲醇溶液：吸取1 mL甲酸溶于甲醇并稀释至1000 mL，临用现配。 3.2.2 盐酸溶液(1mol／L)：吸取8.33 mL浓盐酸，溶于水并稀释至100 mL，临用现配。 3.2.3 甲醇-水溶液(4＋1)：将甲醇和水按4:1(体积比)混合均匀。 3.2.4 0.5％甲酸溶液：吸取5 mL甲酸，溶于水并稀释至1000 mL，临用现配。 3.3 标准品 3.3.1 香兰素标准品(C8H8O3，CAS号：121-33-5)：纯度≥98％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 3.3.2 甲基香兰素标准品(C9H10O3，CAS号：120-14-9)：纯度≥98％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 3.3.3 乙基香兰素标准品(C9H10O3，CAS号：121-32-4)：纯度≥98％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 3.3.4 香豆素标准品(C9H6O2，CAS号：91-64-5)：纯度≥97％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 3.4 标准溶液配制 3.4.1 标准储备液(1 000 mg／L)：准确称取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素各10 mg(精确至0.1 mg)，分别置于10 mL容量瓶中，用0.1％甲酸甲醇溶液溶解并定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内，－18℃下避光保存，保存期8个月。 3.4.2 标准混合中间液(10 mg／L)：吸取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素的标准储备液(1 000 mg／L)各1.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加0.1％甲酸甲醇定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器中，－18℃下避光保存，保存期3个月。 3.4.3 标准混合系列工作液：分别吸取标准混合中间液(10 mg／L)0.2 mL、1.0 mL、5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，另分别吸取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素的标准储备液(1000 mg／L)0.2 mL、0.5 mL和1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇-水溶液定容至刻度，混匀。标准混合系列工作液的浓度分别为0.2 mg／L、1.0 mg／L、5.0 mg／L、20.0 mg／L、50.0 mg／L、100.0 mg／L，临用现配。 4 仪器和设备 4.1 液相色谱仪：配有二极管阵列或紫外检测器。 4.2 天平：感量分别为0.1 mg和0.01 g。 4.3 涡旋混合器。 4.4 离心机。 4.5 氮气浓缩装置。 4.6 超声波发生器。 5 分析步骤 5.1 样品前处理 5.1.1 试样制备 液态试样摇匀；基质均匀的半固态试样和粉状试样直接用于5.1.2试样提取；其他试样需匀浆或粉碎均匀。 5.1.2 试样提取 5.1.2.1 婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品 称取1.00 g试样，加入10 mL水和480μL盐酸溶液，涡旋振荡1 min，加入20 mL乙腈，涡旋振荡1 min，超声提取30 min后，加入5g氯化钠，涡旋振荡2 min，8 000 r／ min离心5 min，取上清液至玻璃试管，40℃氮吹至近干，准确加入1.0 mL甲醇-水溶液溶解残渣，过0.45μm微孔滤膜后，待测。 5.1.2.2 糕点、糖果、乳及乳制品、饮料 称取1.00 g试样，加入5 mL水(胶基糖果加入10 mL水，50℃水浴溶解)，涡旋振荡1 min，加入20 mL乙腈，涡旋振荡1 min，超声提取30 min后，加入5 g氯化钠，涡旋振荡2 min，8000r／ min离心5 min(对于含油脂高的糕点样品，采取冷冻离心，8 000 r／ min)，取上清液至玻璃试管，40℃氮吹至近干，准确加入1.0 mL甲醇-水溶液溶解残渣，过0.45μm微孔滤膜后，待测。 5.1.2.3 小麦粉 称取1.00g试样，加入10 mL水和240μL盐酸溶液，涡旋振荡1 min，加入20 mL乙腈，涡旋振荡1 min，超声提取30 min后，加入5g氯化钠，涡旋振荡2 min，8000r／ min离心5 min，取上清液至玻璃试管，40℃氮吹至近干，准确加入1.0 mL甲醇-水溶液溶解残渣，过0.45μm微孔滤膜后，待测。 5.2 仪器参考条件 5.2.1 色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm(内径)，5μm(填料粒径)或相当者。 5.2.2 柱温：30℃。 5.2.3 进样量：10μL。 5.2.4 检测波长：279nm。 5.2.5 流速：1.0 mL／ min。 5.2.6 流动相 A相：0.5％甲酸溶液； B相：乙腈。 梯度洗脱见表1。 表1 梯度洗脱程序 时间／min A／％ B／％ 5.3 标准曲线的制作 将标准混合系列工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素标准溶液的色谱图参见附录A中图A.1。 5.4 试样溶液的测定 将试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到试样溶液中被测化合物的浓度。 6 分析结果的表述 试样中被测化合物的含量按式(1)计算。 (1) 式中： Xi——试样中被测化合物的含量，单位为毫克每千克( mg／kg)； ρ——由标准曲线得到的试样溶液中被测化合物的浓度，单位为微克每毫升(μg／ mL)； V——试样最终定容体积，单位为毫升(mL)； m——试样的取样量，单位为克(g)。 1 000——换算系数。 注：计算结果需扣除空白值，保留小数点后两位数字。 7 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％。 8 其他 本方法的检出限均为0.07 mg／kg，定量限均为0.20 mg／kg。 第二法 液相色谱-质谱／质谱法 9 原理 试样加水混匀后，经乙腈超声提取，提取液经固相萃取柱净化后，液相色谱-质谱／质谱仪测定，内标法定量。 10 试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB／T 6682规定的一级水。 10.1 试剂及材料 10.1.1 乙腈(CH3CN)：色谱纯。 10.1.2 甲酸(HCOOH)：色谱纯。 10.1.3 甲醇(CH3OH)：色谱纯。 10.1.4 氯化钠(NaCl)。 10.1.5 浓盐酸(HCl)：12mol／L。 10.1.6 含极性基团的反相聚合物固相萃取柱：60 mg、3 mL，或相当者。含极性基团的反相聚合物固相萃取柱吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按照一定比例聚合成的大孔聚合物。使用前用3 mL甲醇、3 mL水活化。 10.1.7 微孔滤膜：0.22μm，有机相型。 10.2 试剂配制 10.2.1 0.1％甲酸甲醇溶液：吸取1 mL甲酸溶于甲醇并稀释至1000 mL，临用现配。 10.2.2 盐酸溶液(1 mol／L)：吸取8.33 mL浓盐酸，溶于水并稀释至100 mL，临用现配。 10.2.3 甲醇-水溶液(4＋1)：将甲醇和水按4:1(体积比)混合均匀。 10.2.4 0.5％甲酸溶液：吸取5 mL甲酸，溶于水并稀释至1000 mL，临用现配。 10.3 标准品 10.3.1 香兰素标准品(C8H8O3，CAS号：121-33-5)：纯度≥98％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 10.3.2 甲基香兰素标准品(C9H10O3，CAS号：120-14-9)：纯度≥98％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 10.3.3 乙基香兰素标准品(C9H10O3，CAS号：121-32-4)：纯度≥98％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 10.3.4 香豆素标准品(C9H6O2，CAS号：91-64-5)：纯度≥97％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 10.3.5 D3-香兰素标准品(C8H5D3O3，CAS号：74495-74-2)：纯度≥98％。 10.3.6 D3-甲基香兰素标准品(C9H7D3O3，CAS号：143318-06-3)：纯度≥98％。 10.3.7 D5-乙基香兰素标准品(C9H5D5O3，CAS号：1335401-74-5)：纯度≥98％。 10.3.8 D4-香豆素标准品(C9H2D4O2，CAS号：185056-83-1)：纯度≥98％。 10.4 标准溶液配制 10.4.1 标准储备液(1000 mg／L)：同3.4.1。 10.4.2 标准混合中间液(10 mg／L)：同3.4.2。 10.4.3 内标储备液(1000 mg／L)：准确称取D3-香兰素、D3-甲基香兰素、D5-乙基香兰素、D4-香豆素各10 mg(精确至0.1 mg)，分别置于10 mL容量瓶中，用0.1％甲酸甲醇溶液溶解并定容至刻度，混匀将溶液转移至棕色玻璃容器内，－18℃下避光保存，保存期8个月。 10.4.4 内标混合中间液(10 mg／L)：吸取D3-香兰素、D3-甲基香兰素、D5-乙基香兰素、D4-香豆素的标准储备液(1 000 mg／L)各1.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加0.1％甲酸甲醇溶液定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内，－18℃下避光保存，保存期3个月。 10.4.5 标准及内标混合系列工作液：分别吸取标准混合中间液(10 mg／L)0.05 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL和内标混合中间液(10 mg／L)0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇-水溶液定容至刻度，混匀。标准及内标混合系列工作液的浓度分别为0.05 mg／L、0.2 mg／L、0.5 mg／L、1.0 mg／L、2.0 mg／L，内标的浓度均为0.1 mg／L。临用现配。 11 仪器和设备 11.1 液相色谱串联四极杆质谱仪：配电喷雾离子源。 11.2 天平：感量为0.1 mg和0.01g。 11.3 涡旋混合器。 11.4 离心机。 11.5 高速冷冻离心机。 11.6 氮气浓缩装置。 11.7 超声波发生器。 11.8 固相萃取装置。 12 分析步骤 12.1 样品前处理 12.1.1 试样制备 液态试样摇匀；基质均匀的半固态试样和粉状试样直接用于12.1.2试样提取；胶基质糖果粉碎，搅匀；其他试样需匀浆或粉碎均匀。 12.1.2 试样提取 12.1.2.1 婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品 称取1.00g试样，加入10μL内标混合中间液，加入10 mL水和480μL盐酸溶液，涡旋振荡1 min，加入20 mL乙腈，涡旋振荡1 min，超声提取30 min后，加入5g氯化钠，涡旋振荡2 min，8 000 r／min离心5 min，取上清液至玻璃试管，待净化。 12.1.2.2 糕点、糖果、乳及乳制品、饮料 称取1.00g试样，加入10μL内标混合中间液，加入5 mL水(胶基糖果加入10 mL水，50℃水浴溶解)，涡旋振荡1 min，加入20 mL乙腈，涡旋振荡1 min，超声提取30 min后，加入5g氯化钠，涡旋振荡2 min，8 000 r／min离心5 min(对于含油脂高的糕点样品，采取冷冻离心，8 000 r／min)，取上清液至玻璃试管，待净化。 12.1.2.3 小麦粉 称取1.00g试样，加入10μL内标混合中间液，加入10 mL水和240μL盐酸溶液，涡旋振荡1 min，加入20 mL乙腈，涡旋振荡1 min，超声提取30 min后，加入5g氯化钠，涡旋振荡2 min，8 000 r／min离心5 min，取上清液至玻璃试管，待净化。 12.1.3 试样净化 将12.1.2中得到的上清液于40℃氮吹至近干，加入1 mL甲醇溶解残渣，用水定容至10 mL，使该样液以小于1 mL／min的流速通过固相萃取柱。样液全部流出后，用5 mL水淋洗，负压抽干，10 mL甲醇-水溶液洗脱，负压抽干，收集洗脱液，40℃氮吹至近干，准确加入1 mL甲醇-水溶液溶解残渣，过0.22μm微孔滤膜后，待测。 12.2 仪器参考条件 12.2.1 液相色谱参考条件 12.2.1.1 色谱柱：C18柱，100mm×2.1mm(内径)，1.8μm(填料粒径)，或相当者。 12.2.1.2 进样量：5μL。 12.2.1.3 柱温：30℃。 12.2.1.4 流速：0.3 mL／min。