标准编号:	GB/T 31270.14-2014
中文名称:	化学农药环境安全评价试验准则 第14部分：藻类生长抑制试验
英文名称:	Test guidelines on environmental safety assessment for chemical pesticides. Part 14: Alga growth inhibition test
中标分类:	B13    肥料与土壤调理剂
行业分类:	GB    国家标准
ICS分类:	65.100 65.100    杀虫剂和其他农用化工产品 65.100
发布机构:	中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会
发布日期:	2014-10-10
实施日期:	2015-3-11
标准状态:	valid
翻译语言:	英文
文件格式:	PDF
中文字符数:	15000 字
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Codeofchina.com is in charge of this English translation. In case of any doubt about the English translation, the Chinese original shall be considered authoritative. GB/T 31270 consists of 21 parts under the general title Test guidelines on environmental safety assessment for chemical pesticides: ——Part 1: Transformation in soils; ——Part 2: Hydrolysis; ——Part 3: Phototransformation; ——Part 4: Adsorption/desorption; ——Part 5: Leaching in soil; ——Part 6: Volatility; ——Part 7: Bioconcentration test; ——Part 8: Degradation in water-sediment systems; ——Part 9: Avian acute toxicity test; ——Part 10: Honeybee acute toxicity test; ——Part 11: Silkworm acute toxicity test; ——Part 12: Fish acute toxicity test; ——Part 13: Daphnia sp.acute immobilisation test; ——Part 14: Alga growth inhibition test; ——Part 15: Earthworm acute toxicity test; ——Part 16: Soil microorganism toxicity test; ——Part 17: Trichogramma acute toxicity test; ——Part 18: Amphibian acute toxicity test; ——Part 19: Effects on non-target plants; ——Part 20: Livestock short-term dietary toxicity test; ——Part 21: Macro-crustacean toxicity test. This is Part 14 of GB/T 31270. This part is developed in accordance with the rules given in GB/T 1.1-2009. Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent rights. The issuing body of this document shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. This standard was proposed by and is under the jurisdiction of the Ministry of Agriculture of the People's Republic of China. Test guidelines on environmental safety assessment for chemical pesticides - Part 14: Alga growth inhibition test 1 Scope This part of GB/T 31270 specifies the basic requirements for materials, conditions, operation, quality control, data processing, test reports, etc. for alga growth inhibition test. This part applies to alga growth inhibition test for the registration of chemical pesticides. It may be used as reference for other types of pesticides. This part does not apply to volatile and insoluble chemical pesticides. 2 Terms and definitions For the purposes of this document, the following terms and definitions apply. 2.1 median effective concentration concentration of test substance that makes the yield or growth rate of test organism to be decreased by 50% compared with that of control group in the growth inhibition test, which is expressed by EC50. In this part, the median effective concentration obtained by calculating the inhibition percentage of alga yield is expressed by EyC50, while that obtained by calculating the inhibition percentage of alga growth rate is expressed by ErC50 Note: the unit is mg a.i./L. 2.2 average growth rate logarithm of unit yield of alga within certain exposure duration, expressed by μ 2.3 yield increasing amount of unit biomass of alga within certain exposure duration, i.e. the amount of unit biomass at the end of exposure deducted by the unit biomass at the beginning of exposure, expressed by Y 2.4 test substance substance to be tested 2.5 chemical pesticide pesticide made of chemical substances through artificial synthesis, for some, the active substances in natural products are used as the mother body, and then subjected to imitation, structural transformation and innovation, they are bionic synthetic pesticides Synonym: synthetic organic pesticide. [Definition 2.3.1, NY/T 1667.1-2008] 2.6 technical material final product consisting of the active ingredients and impurities obtained during the manufacturing process, which shall not contain visible foreign substances or any additives, and if necessary, a small amount of stabilizer may be added [Definition 2.5.1, NY/T 1667.2-2008] 2.7 formulation product product stable in use and made of technical material (or technical concentrate) of pesticides and auxiliaries [Definition 3.1, NY/T 1667.2-2008] 2.8 active ingredient; a.i. specific chemical ingredient that is biologically active in a pesticide product [Definition 3.1, NY/T 1667.2-2008] 2.9 reference substances chemical substance or mixture used in a test to confirm or deny certain characteristics of a test substance or to judge the effectiveness of a test system 3 Test overview In this test, prepare a series of test liquids with different concentrations using a test substance, then observe the growth inhibition of test alga for consecutive 72h after mixing the test liquids with alga liquid, and calculate the median effective concentration EC50 (72h) and 95% confidence limit. 4 Test methods 4.1 Materials and conditions 4.1.1 Test organism For test alga, Chlorella vulgaris, Desmodesmus subspicatus or Pseudokirchneriella subcapitata are recommended. 4.1.2 Test substance Pesticide formulation product, technical material or pure pesticides is adopted. For insoluble pesticides, a small amount of organic solvents, emulsifiers or dispersing agents which are low in toxicity to alga may be used, and the amount thereof shall not exceed 0.1mL(g)/L. 4.1.3 Main apparatus and instruments Main apparatus and instruments are as follows: ——acidometer; ——hemocytometer; ——spectrophotometer; ——microscope; ——artificial climate box; ——high-pressure steam sterilization pot; ——glassware, etc. 4.1.4 Culture medium It is recommended to culture Desmodesmus subspicatus in 4# aquatic culture medium, culture Pseudokirchneriella subcapitata in BG11 culture medium and culture Chlorella vulgaris in BG11 culture medium or SE culture medium, and the formula for such culture mediums are given in Annex A. The name, formula and other information of any other culture medium (if used) shall be provided simultaneously; where other alga is used, suitable culture medium shall be selected and the name and formula thereof shall also be provided. 4.1.5 Test conditions The test environment temperature is 21℃~24℃ (with temperature for single test controlled at ±2℃); the illumination is continuous and uniform with illumination intensity difference kept within ±15% and with light intensity of 4440lx~8880lx。 4.2 Test operations 4.2.1 Pre-culture of test alga Inoculate the test alga into a conical flask with culture medium by using aseptic method for culture under the conditions specified in 4.1.5. Inoculate once every 96h and repeat the inoculation for 2~3 times to ensure the alga basically reaching the synchronous growth stage so as to serve as test alga. The growth of algae is inspected by observing with a microscope each time the inoculation is performed. 4.2.2 Pre-test Set several groups of concentrations at a large difference according to the formal test conditions so as to calculate the lowest concentration of test substance to inhibit the growth of test alga and the highest concentration not inhibiting the growth of test alga, hereby set the concentration for formal test within such range. 4.2.3 Formal test Set 5~7 concentration groups at certain proportional difference within the concentration range determined by the pre-test (geometrical difference shall be controlled within 3.2 times), and set a blank control group. If cosolvent is used, a solvent control group shall also be added, and 3 replicate are set for each concentration group. The test observation period lasts for 72h, and sample every other 24h. Accurately count the algae cell number with a hemocytometer under a microscope or directly determine the absorbance of alga with a spectrophotometer. When counting with a hemocytometer, the same sample shall be counted for at least twice. If the difference of counting results is greater than 15%, the counting shall be repeated. Select the appropriate technical method based on the properties of test substances. 4.2.4 Limit test Set the upper concentration limit as 100mg a.i./L, that is, the alga is not affected if the test substance reaches 100mg a.i./L. If the solubility of the test substance is less than 100mg a.i./L, the upper solubility limit will be used as the test concentration. Set at least 6 replicates for the control group and treatment group, and conduct difference significance analysis for the concentration group and control group (e.g. t inspection). 4.2.5 Reference substance test The reference substance is adopted for reliability inspection in methodology so as to inspect whether the equipment, conditions and method of laboratory and quality of test organism meet the requirements. The green alga is tested by using reference substance (at least twice a year); 3,5-dichlorophenol and potassium dichromate are recommended. 4.3 Data processing 4.3.1 Inhibition percentage of yield The inhibition percentage of alga yield in treatment group is calculated using Equation (1): (1) Where, Iy——the inhibition percentage of yield in treatment group, %; Yc——the unit biomass of alga determined by blank control group, pcs/mL if it is expressed by cell number; Yt——the unit biomass of alga determined by treatment group, pcs/mL if it is expressed by cell number. 4.3.2 Inhibition percentage of growth rate The inhibition percentage of alga growth rate in treatment group is calculated using Equation (2): (2) Where, Ir——the inhibition percentage of alga growth rate in treatment group, %; μc——the average growth rate of blank control group; μt——the average growth rate of treatment group. Thereof, μ is calculated using Equation (3): (3) Where, μj-i——the average growth rate between time points i and j; Xi——the unit biomass of alga at time point i, pcs/mL if it is expressed by cell number; Xj——the unit biomass of alga at time point j, pcs/mL if it is expressed by cell number. 4.3.3 Median effective concentration 4.3.3.1 Selection of statistical analysis method Calculate median effective concentrations EyC50 and ErC50 respectively based on inhibition percentages of alga yield and alga growth rate. The alga data are analyzed with appropriate statistical software and the median effective concentrations and 95% confidence limits at each observation time (24h, 48h and 72h) are calculated. 4.3.3.2 Karber method EC50 and 95% confidence limits of alga at 24h, 48h and 72h may be obtained by Karber method. EC50 is calculated using Equation (4): logEC50=Xm-i(∑P-0.5) (4) Where, Xm——the logarithm of the highest concentration; i——the logarithm of the ratio of two adjacent concentrations; ∑P——the sum of the inhibition rate of each group (in decimal). 95% confidence limit is calculated using Equation (5): 95% confidence limit=logEC50±1.96SlogEC50 (5) Standard error is calculated using Equation (6): (6) Where, p——the inhibition rate of one group; q——1-p; n——the growth rate or yield of each concentration group. 4.3.3.3 Linear interpolation method The linear scale coordinates are used to plot the curve for inhibition percentage versus the test substance concentration, and the EC50 at 50% immobilisation is calculated. 4.3.3.4 Probit graphical method A graph with the logarithm concentration as X-coordinate and the probit corresponding to the inhibition percentage as Y-coordinate is plotted in the semi-logarithmic paper. A straight line is drawn on the graph based on the measured values with visual method, and the logarithm concentration at 50% immobilisation is obtained from the straight line to estimate EC50.

Foreword i 1 Scope 2 Terms and definitions 3 Test overview 4 Test methods 5 Test report Annex A (Informative) Formula of culture medium Annex B (Normative) Classification of toxicity levels of pesticides to alga Bibliography

ICS 65.100 B 13 中华人民共和国国家标准 GB/T 31270.14—2014 化学农药环境安全评价试验准则 第14部分：藻类生长抑制试验 Test guidelines on environmental safety assessment for chemical pesticides— Part 14：Alga growth inhibition test 2014—10—10发布 2015—03—11实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布 前言 GB/T 31270《化学农药环境安全评价试验准则》分为21个部分： ——第1部分：土壤降解试验； ——第2部分：水解试验； ——第3部分：光解试验； ——第4部分：土壤吸附/解吸试验； ——第5部分：土壤淋溶试验； ——第6部分：挥发性试验； ——第7部分：生物富集试验； ——第8部分：水-沉积物系统降解试验； ——第9部分：鸟类急性毒性试验； ——第10部分：蜜蜂急性毒性试验； ——第11部分：家蚕急性毒性试验； ——第12部分：鱼类急性毒性试验； ——第13部分：溞类急性活动抑制试验； ——第14部分：藻类生长抑制试验； ——第15部分：蚯蚓急性毒性试验； ——第16部分：土壤微生物毒性试验； ——第17部分：天敌赤眼蜂急性毒性试验； ——第18部分：天敌两栖类急性毒性试验； ——第19部分：非靶标植物影响试验； ——第20部分：家畜短期饲喂毒性试验； ——第21部分：大型甲壳类生物毒性试验。 本部分是GB/T 31270的第14部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。 化学农药环境安全评价试验准则 第14部分：藻类生长抑制试验 1 范围 GB/T 31270的本部分规定了藻类生长抑制试验的材料、条件、操作、质量控制、数据处理、试验报告等的基本要求。 本部分适用于为化学农药登记而进行的藻类生长抑制试验，其他类型的农药可参照使用。 本部分不适用于易挥发和难溶解的化学农药。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 半效应浓度median effective concentration 在生长抑制试验中，使供试生物生物量增长或者生长率比对照下降50％时的供试物浓度，用EC50表示。在本部分中，通过藻类生物量增长的抑制百分率计算而得到的半效应浓度用EyC50表示，通过藻类生长率的抑制百分率计算而得的半效应浓度用ErC50表示。 注：单位为mg a.i./L。 2.2 平均生长率average growth rate 一定暴露时间内藻类单位生物量增长的对数值，在本部分中用μ表示。 2.3 生物量增长yield 一段暴露时间内藻类单位生物量的增加量，即暴露结束时的单位生物量减去暴露开始时的单位生物量，在本部分中用Y表示。 2.4 供试物test substance 试验中需要测试的物质。 2.5 化学农药 chemical pesticide 利用化学物质人工合成的农药。其中有些以天然产品中的活性物质为母体，进行仿制、结构改造，创新而成，为仿生合成农药。 同义词：有机合成农药synthetic organic pesticide。 [NY/T 1667.1—2008，定义2.3.1] 2.6 原药technical material 在制造过程中得到的有效成分及杂质组成的最终产品，不能含有可见的外来物质和任何添加物，必要时可加入少量的稳定剂。 [NY/T 1667.2—2008，定义2.5.1] 2.7 制剂 formulation product 由农药原药(或母药)和助剂制成使用状态稳定的产品。 [NY/T 1667.2—2008，定义3.1] 2.8 有效成分active ingredient；a.i. 农药产品中具有生物活性的特定化学结构成分。 [NY/T 1667.2—2008，定义3.1] 2.9 参比物质 reference substances 在测试中为证实或否定供试物的某种特性或判断测试系统有效性而使用的化学物质或混合物。 3试验概述 本试验用供试物配制一系列不同浓度的试验药液，然后将试验药液与藻液混合后，连续72 h观察试验用藻的生长抑制情况，并求出半效应浓度EC50(72 h)值以及95％置信限。 4试验方法 4.1材料和条件 4.1.1供试生物 试验用藻推荐采用普通小球藻(Chlorella vulgaris)、斜生栅列藻(Desmodesmus subspicatus)或羊角月芽藻(Pseudokirchneriella subcapitata)等。 4.1.2供试物 农药制剂、原药或纯品。对难溶于水的农药，可用少量对藻毒性小的有机溶剂、乳化剂或分散剂助溶，用量不得超过0.1 mL(g)/L。 4.1.3主要仪器设备 主要仪器设备如下： ——酸度计； ——血球计数板； ——分光光度计； ——显微镜； ——人工气候箱； ——高压蒸汽灭菌锅； ——玻璃器皿等。 4.1.4培养基 推荐选择水生4号培养基培养斜生栅列藻，选择BG11培养基培养羊角月芽藻，选择BG11培养基或SE培养基培养普通小球藻，上述培养基配方参见附录A。若使用其他培养基应同时提供培养基名称和配方等信息；若使用其他藻种，应选择适宜的培养基，并同时提供培养基名称和配方等信息。 4.1.5试验条件 试验环境温度21℃～24℃(单次试验温度控制在±2℃)；连续均匀光照，光照强度差异应保持在±15％范围内，光强4 440 lx～8 880 lx。 4.2试验操作 4.2.1试验用藻的预培养 按无菌操作法将试验用藻接种到装有培养基的锥形瓶内，在4.1.5的条件下培养。每隔96 h接种一次，反复接种2次～3次，使藻基本达到同步生长阶段，以此作为试验用藻。每次接种时在显微镜下观察，检查藻种的生长情况。 4.2.2 预试验 按正式试验的条件，以较大的间距设置若干组浓度，求出供试物使试验用藻生长受抑制的最低浓度和不受抑制的最高浓度，在此范围内设置正式试验的浓度。 4.2.3 正式试验 在预试验确定的浓度范围内以一定比例间距(几何级差应控制在3.2倍以内)设置5个～7个浓度组，并设一个空白对照组，使用助溶剂的还应增设溶剂对照组，每个浓度组设3个重复。试验观察期为72 h，每隔24 h取样，在显微镜下用血球计数板准确计数藻细胞数，或用分光光度计直接测定藻的吸光率。用血球计数板计数时，同一样品至少计数两次，如计数结果相差大于15％，应予重复计数。依据试验物质性质选择合适的技术方法。 4.2.4限度试验 设置上限浓度为100 mg a.i./L，即在供试物达100 mg a.i./L时，未对藻产生影响。若供试物溶解度小于100 mg a.i./L，则采用其溶解度上限作为试验浓度。对照组和处理组至少设置6个重复，并且对浓度组和对照组进行差异显著性分析(比如t检验)。 4.2.5 参比物质试验 为检验实验室的设备、条件、方法及供试生物的质量是否合乎要求，设置参比物质作方法学上的可靠性检验。使用参比物质(每年至少两次)对绿藻进行检测，推荐使用3，5-二氯苯酚和重铬酸钾。 4.3数据处理 4.3.1 生物量增长的抑制百分率 处理组藻类生物量增长的抑制百分率按式(1)计算： (1) 式中： Iy——处理组生物量增长的抑制百分率，％； Yc——空白对照组测定的藻类单位生物量，用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL)； Yt——处理组测定的藻类单位生物量，用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL)。 4.3.2生长率的抑制百分率 处理组藻类生长率的抑制百分率按式(2)计算： (2) 式中： Ir——处理组藻类生长率的抑制百分率，％； μc——空白对照组生长率的平均值； μt——处理组生长率平均值。其中μ按式(3)计算： (3) 式中： μj-i——在时间点i到时间点j之间的平均生长率； Xi——在时间点i时的藻类单位生物量，用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL)； Xj——在时间点j时的藻类单位生物量，用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL)。 4.3.3半效应浓度 4.3.3.1 统计分析方法的选择 按藻类生物量增长的抑制百分率和藻类生长率的抑制百分率分别计算半效应浓度EyC50和ErC50。采用合适的统计学软件分析藻类数据，计算得到每一观察时间(24 h、48 h、72 h)的半效应浓度和95％置信限。 4.3.3.2 寇氏法 用寇氏法可求出藻类在24 h、48 h和72 h的EC50值及95％置信限。 EC50的计算见式(4)： logEC50=Xm-i(∑P-0.5) (4) 式中： Xm——最高浓度的对数； i——相邻浓度比值的对数； ∑P——各组抑制率的总和(以小数表示)。 95％置信限的计算见式(5)： 95％置信限=logEC50±1.96SlogEC50 (5) 标准误的计算见式(6)： (6) 式中： p——1个组的抑制率； q——1-p； n——各浓度组的生长率或生物量增长。 4.3.3.3直线内插法 采用线性刻度坐标，绘制抑制百分率对试验物质浓度的曲线，求出50％活动抑制时的EC50值。 4.3.3.4概率单位图解法 用半对数纸，以浓度对数为横坐标、抑制百分率对应的概率单位为纵坐标绘图。将各实测值在图上用目测法画一条相关直线，从直线中读出活动抑制50％的浓度对数，估算出EC50值。 4.4质量控制 质量控制条件包括： ——供试生物应是处于对数生长期的纯种藻； ——对照组和各浓度组的试验温度、光照等环境条件应按要求完全一致； ——试验起始斜生栅列藻浓度应控制在2.0×103个/mL～5.0×103个/mL左右，羊角月芽藻应控制在5.0×103个/mL～5.0×104个/mL左右，普通小球藻应控制在1.0×104个/mL～2.0×104个/mL左右； ——试验开始后72 h内，对照组藻细胞浓度应至少增加16倍。 5试验报告 试验报告应包括下列内容： ——供试物的信息，包括供试农药的通用名、化学名称、结构式、CAS号、纯度、基本理化性质、来源等； ——供试生物名称、来源、培养基及培养方法； ——试验条件，包括试验持续时间、温度、光照(光强和光周期)、试验容器(容量、型号、密闭方法)、静置、振荡或通气方式、测试液体积、pH、溶剂及其浓度、藻类生长的测定方法等； ——供试物的浓度与抑制曲线图，得出的ErC50、EyC50值，并注明计算方法； ——观察到的效应：细胞颜色、形态和大小变化；粘连或聚结情况；死亡、抑藻或杀藻效应情况等； ——试验质量控制条件描述； ——对藻的毒性等级划分见附录B。 附 录 A (资料性附录) 培养基配方 水生4号、BG11、SE培养基的配方分别参见表A.1～表A.3。 表A.1 水生4号培养基配方 序号 组分 用量 1 硫酸铵(NH4)2SO4 2.00 g 2 过磷酸钙饱和液Ca(H2PO4)2·H2O·(CaSO4·H2O) 10.0 mL 3 硫酸镁MgSO4·7H2O 0.80 g 4 碳酸氢钠NaHCO3 1.00 g 5 氯化钾KCl 0.25 g 6 三氯化铁1％溶液FeCl3 1.50 mL 7 土壤提取液a 5.00 mL 以上成分用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，经高压灭菌(121℃，15 min)，密封并贴好标签，4℃冰箱保存，有效期2个月。该培养基用经高压灭菌(121℃，15 min)的蒸馏水稀释10倍后即可使用。 a取未施过肥的花园土200 g置于烧杯或锥形瓶中，加入蒸馏水1 000 mL，瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热3 h，冷却，沉淀24 h，此过程连续进行3次，然后过滤，取上清液，于高压灭菌锅中灭菌后于4℃冰箱中保存备用。 表A.2 BG11培养基配方 序号 组分 母液浓度 母液用量 1 硝酸钠NaNO3 15 g/100 mL蒸馏水 10 mL 2 磷酸氢二钾K2HPO4 2 g/500 mL蒸馏水 10 mL 3 七水硫酸镁MgSO4·7H2O 3.75 g/500 mL蒸馏水 10 mL 4 二水氯化钙CaCl2·2H2O 1.8 g/500 mL蒸馏水 10 mL 5 柠檬酸C6H8O7 0.3 g/500 mL蒸馏水 10 mL 6 柠檬酸酸铁铵FeC6H5O7·NH4OH 0.3 g/500 mL蒸馏水 10 mL 7 EDTA钠盐EDTANa2 0.05 g/500 mL蒸馏水 10 mL 8 碳酸钠Na2CO3 1.0 g/500 mL蒸馏水 10 mL 9 A5(Trace mental solution) 1 mL/L 硼酸H3BO3 2.86 g/L蒸馏水 1 mL 四水氯化锰MnCl2·4H2O 1.86 g/L蒸馏水 七水硫酸锌ZnSO4·7H2O 0.22 g/L蒸馏水 二水钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.39 g/L蒸馏水 五水硫酸铜CuSO4·5H2O 0.08 g/L蒸馏水 六水硝酸钴Co(NO3)2·6H2O 0.05 g/L蒸馏水 将以上各成分配制成相应母液浓度，并按照标明顺序依次将相应母液用量转移至1 000 mL容量瓶中，定容，经高压灭菌(121℃，15 min)，密封并贴好标签，4℃冰箱保存，有效期2个月。该培养基用经高压灭菌(121℃，15 min)的蒸馏水稀释10倍后即可使用。 表A.3 SE培养基配方 序号 组分 母液浓度 母液用量 1 硝酸钠NaNO3 25 g/100 mL蒸馏水 1 mL 2 磷酸氢二钾K2HPO4 7.5 g/100 mL蒸馏水 1 mL 3 七水硫酸镁MgSO4·7H2O 7.5 g/100 mL蒸馏水 1 mL 4 二水氯化钙CaCl2·2H2O 2.5 g/100 mL蒸馏水 1 mL 5 磷酸二氢钾KH2PO4 17.5 g/100 mL蒸馏水 1 mL 6 氯化钠NaCl 2.5 g/100 mL蒸馏水 1 mL 7 六水氯化铁FeCl3·6H2O 0.5 g/100 mL蒸馏水 1 mL 8 EDTA铁盐EDTA-Fea — 1 mL 9 A5(Trace mental solution) 硼酸H3BO3 2.86 g/L蒸馏水 1 mL 四水氯化锰MnCl2·4H2O 1.86 g/L蒸馏水 七水硫酸锌ZnSO4·7H2O 0.22 g/L蒸馏水 二水钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.39 g/L蒸馏水 五水硫酸铜CuSO4·5H2O 0.08 g/L蒸馏水 六水硝酸钴Co(NO3)2·6H2O 0.05 g/L蒸馏水 10 土壤提取液b — 40 mL 将以上各成分配制成相应母液浓度，并按照标明顺序依次将相应母液用量转移至1 000 mL容量瓶中，定容，经高压灭菌(121℃，15 min)，密封并贴好标签，4℃冰箱保存，有效期2个月。该培养基用经高压灭菌(121℃，15 min)的蒸馏水稀释10倍后即可使用。 a 1 mol/L HCl：取4.1 mL浓盐酸用蒸馏水稀释至50 mL。称取0.1 mol/L EDTA-Na2 0.930 6 g溶解至50 mL 蒸馏水中。称取FeCl3·6H2O 0.901 g溶于10 mL以上步骤已经配制完成的1 mol/L HCl中，然后与10 mL 已经配制完成的0.1 mol/L EDTA-Na2混合，加入蒸馏水稀释至1 000 mL。 b 取未施过肥的花园土200 g置于烧杯或锥形瓶中，加入蒸馏水1 000 mL，瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热3 h，冷却，沉淀24 h，此过程连续进行3次，然后过滤，取上清液，于高压灭菌锅中灭菌后于4℃冰箱中保存备用。 附 录 B (规范性附录) 农药对藻类毒性等级划分 按藻类生长抑制半效应浓度EC50(72 h)值，将农药对藻类毒性等级划分为三级，见表B.1。 表B.1 农药对藻类的毒性等级划分 毒性等级 EC50(72 h)/(mg a.i./L) 高毒 EC50≤0.3 中毒 0.33.0 参考文献 [1]NY/T 1667.1—2008农药登记管理术语 第1部分：基本术语 [2] NY/T 1667.2—2008农药登记管理术语 第2部分：产品化学 [3] FAO(1989).Guidelines on environmental criteria for the registration of pesticides. Food and Agriculture Organization of the United Nations. [4] OECD(2011).Guideline 201：Freshwater Alga and Cyanobacteria，Growth Inhibition Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. [5]US EPA.(1985).Part II，Toxic substances control act test Guidelines，Final Rules，Federal register. [6] 蔡道基.农药环境毒理学研究.北京：中国环境科学出版社，1999.