标准编号:	GB/T 31270.13-2014
中文名称:	化学农药环境安全评价试验准则 第13部分：溞类急性活动抑制试验
英文名称:	Test guidelines on environmental safety assessment for chemical pesticides. Part 13: Daphnia sp. acute immobilisation test
中标分类:	B13    肥料与土壤调理剂
行业分类:	GB    国家标准
ICS分类:	65.100 65.100    杀虫剂和其他农用化工产品 65.100
发布机构:	中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会
发布日期:	2014-10-10
实施日期:	2015-3-11
标准状态:	valid
翻译语言:	英文
文件格式:	PDF
中文字符数:	15000 字
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Codeofchina.com is in charge of this English translation. In case of any doubt about the English translation, the Chinese original shall be considered authoritative. GB/T 31270 consists of 21 parts under the general title Test guidelines on environmental safety assessment for chemical pesticides: ——Part 1: Transformation in soils; ——Part 2: Hydrolysis; ——Part 3: Phototransformation; ——Part 4: Adsorption/desorption; ——Part 5: Leaching in soil; ——Part 6: Volatility; ——Part 7: Bioconcentration test; ——Part 8: Degradation in water-sediment systems; ——Part 9: Avian acute toxicity test; ——Part 10: Honeybee acute toxicity test; ——Part 11: Silkworm acute toxicity test; ——Part 12: fish acute toxicity test; ——Part 13: Daphnia sp. acute immobilisation test; ——Part 14: Alga growth inhibition test; ——Part 15: Earthworm acute toxicity test; ——Part 16: Soil microorganism toxicity test; ——Part 17: Trichogramma acute toxicity test; ——Part 18: Amphibian acute toxicity test; ——Part 19: Effects on non-target plants; ——Part 20: Livestock short-term dietary toxicity test; ——Part 21: Macro-crustacean toxicity test. This is Part 13 of GB/T 31270. This part is developed in accordance with the rules given in GB/T 1.1-2009. Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent rights. The issuing body of this document shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. This standard was proposed by and is under the jurisdiction of the Ministry of Agriculture of the People's Republic of China. Test guidelines on environmental safety assessment for chemical pesticides - Part 13: Daphnia sp. acute immobilisation test 1 Scope This part of GB/T 31270 specifies the basic requirements for materials, conditions, operation, quality control, data processing, test reports, etc. for daphnia sp. acute immobilisation test. This part applies to daphnia sp. acute immobilisation test for the registration of chemical pesticides. It may be used as reference for other types of pesticides. This part does not apply to volatile and insoluble chemical pesticides. 2 Terms and definitions For the purposes of this document, the following terms and definitions apply. 2.1 median effective concentration concentration of the test substance, at which 50% of the test organisms are immobilised in the acute immobilisation test, expressed by EC50 Note: the unit is mg a.i./L. 2.2 immobilisation phenomenon that the daphnia is not able to swim (but weak movement of appendages is allowed) within 15s when gently shaking the test vessel 2.3 test substance substance to be tested 2.4 chemical pesticide pesticide made of chemical substances through artificial synthesis, for some, the active substances in natural products are used as the mother body, and then subjected to imitation, structural transformation and innovation, they are bionic synthetic pesticides Synonym: synthetic organic pesticide. [Definition 2.3.1, NY/T 1667.1-2008] 2.5 technical material final product consisting of the active ingredients and impurities obtained during the manufacturing process, which shall not contain visible foreign substances or any additives, and if necessary, a small amount of stabilizer may be added [Definition 2.5.1, NY/T 1667.2-2008] 2.6 formulation product product stable in use and made of technical material (or technical concentrate) of pesticides and auxiliaries [Definition 2.4, NY/T 1667.2-2008] 2.7 active ingredient; a.i. specific chemical ingredient that is biologically active in a pesticide product [Definition 3.1, NY/T 1667.2-2008] 2.8 reference substances chemical substance or mixture used in a test to confirm or deny certain characteristics of a test substance or to judge the effectiveness of a test system 3 Test overview Prepare a series of test liquids with different concentrations, then observe the toxicity symptoms and immobilisation of test daphnia for consecutive 48h after transferring them into the test liquids, and calculate the EC50 (48h) and 95% confidence limit. 4 Test methods 4.1 Materials and conditions 4.1.1 Test organism Daphnia magna Straus is recommended; good culture conditions shall be maintained to make the reproduction of Daphnia magna Straus into parthenogenesis state. Non-firstborn daphnia born within 24h and cultured for more than 3 generations under laboratory conditions are selected. The test daphnia shall be healthy daphnia from the same maternal line, i.e., it does not show any signs of stress (e.g. high death rate, occurrence of male daphnia and winter eggs, delayed firstborn, abnormal body color, etc.). 4.1.2 Test substance Formulation products, technical materials or pure pesticides shall be used as test substance. For insoluble pesticides, a small amount of organic solvents which are low in toxicity to daphnia sp. may be used, and in general, the amount thereof shall not exceed 0.1mL(g)/L. 4.1.3 Reference substance Potassium dichromate (superior to analytically pure). 4.1.4 Main apparatus and instruments Main apparatus and instruments are as follows: ——dissolved oxygen meter; ——pH meter; ——water hardness analyzer; ——electronic balance; ——pipette; ——containers made of glass or other chemically inert materials, etc. 4.1.5 Test water Recombinant water is recommended for the culture, domestication and test of daphnia, and the use of other water shall meet the requirements of Annex A. The use of ISO standard diluted water, Elendt M4 and Elendt M7 nutrient solutions as recombinant water is recommended. See Annex B for the preparation method. Elendt M4 and Elendt M7 nutrient solutions shall not be used for tests of substances containing metal. During the test, the water quality shall be stable with a pH of 6.0~9.0 and dissolved oxygen of ≥3.0mg/L. For Daphnia magna Straus, the water hardness (calculated by CaCO3) is 140~250mg/L, which may be appropriately reduced for other daphnia sp. 4.1.6 Test conditions Test temperature is 18℃~22℃; in the same test, the temperature change shall be controlled within ±1℃; lighting cycle (light-dark ratio) is 16h:8h or in fully dark conditions (especially test substances unstable under light). During the test, the test vessel shall not be inflated and the pH shall not be adjusted, and feeding shall not be carried out for the test daphnia. 4.2 Test operations 4.2.1 Pre-test According to the conditions of formal test, expose the daphnia sp. to a large range of concentrations of the test liquids for 48h, with 5 daphnia larva placed at each concentration, and replicate may not be required to determine the concentration range of the formal test. 4.2.2 Formal test Set at least 5 concentration groups at certain proportional spacing within the concentration range determined by the pre-test (geometrical difference shall be controlled within 2.2 times), and set a blank control group. If cosolvent is used, a solvent control group shall also be added. Set 4 replicates respectively for each concentration and control group, with at least 5 test daphnia each replicate and with a carrying capacity of not less than 2mL each daphnia. If the number for test concentration is less than 5, a reasonable explanation shall be given in the report. Observe and record the immobilisation number and abnormal symptoms or manifestations of test daphnia in each vessel at 24h and 48h after the start of the test. 4.2.3 Limit test Set the upper concentration limit as 100mg a.i./L, i.e. the test daphnia inhibition rate shall not exceed 10% when the test substance reaches 100mg a.i./L, and there is no need to continue the test; otherwise formal test shall be carried out. If the solubility of the test substance is less than 100mg a.i./L, the maximum solubility is used as the upper concentration limit. 4.2.4 Reference substance test The reference substance is adopted for reliability inspection in methodology so as to inspect whether the equipment, conditions and method of laboratory and quality of test organism meet the requirements. Reference substance test shall be carried out on a regular basis (at least quarterly). Potassium dichromate is adopted as reference substance. 4.2.5 Operational requirements During the operation and test, daphnia shall not leave the water, and glass dropper is used to transfer them. 4.3 Data processing 4.3.1 Selection of statistical analysis method Karber method, linear interpolation method or probit graphical method may be adopted to observe the median effective concentration EC50 of daphnia sp. at each observation time (24h and 48h); relevant statistical software may also be adopted for data analysis and calculation.

Foreword i 1 Scope 2 Terms and definitions 3 Test overview 4 Test methods 5 Test report Annex A (Informative) Partial chemical properties of qualified test water Annex B (Informative) Preparation of recombinant water Annex C (Informative) Classification of toxicity levels of pesticides to daphnia sp. Bibliography

ICS 65.100 B 13 中华人民共和国国家标准 GB/T 31270.13—2014 化学农药环境安全评价试验准则 第13部分：溞类急性活动抑制试验 Test guidelines on environmental safety assessment for chemical pesticides— Part 13：Daphnia sp. acute immobilisation test 2014—10—10发布 2015—03—11实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布 前言 GB/T 31270《化学农药环境安全评价试验准则》分为21个部分： ——第1部分：土壤降解试验； ——第2部分：水解试验； ——第3部分：光解试验； ——第4部分：土壤吸附/解吸试验； ——第5部分：土壤淋溶试验； ——第6部分：挥发性试验； ——第7部分：生物富集试验； ——第8部分：水-沉积物系统降解试验； ——第9部分：鸟类急性毒性试验； ——第10部分：蜜蜂急性毒性试验； ——第11部分：家蚕急性毒性试验； ——第12部分：鱼类急性毒性试验； ——第13部分：溞类急性活动抑制试验； ——第14部分：藻类生长抑制试验； ——第15部分：蚯蚓急性毒性试验； ——第16部分：土壤微生物毒性试验； ——第17部分：天敌赤眼蜂急性毒性试验； ——第18部分：天敌两栖类急性毒性试验； ——第19部分：非靶标植物影响试验； ——第20部分：家畜短期饲喂毒性试验； ——第21部分：大型甲壳类生物毒性试验。 本部分是GB/T 31270的第13部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。 化学农药环境安全评价试验准则 第13部分：溞类急性活动抑制试验 1 范围 GB/T 31270的本部分规定了溞类急性活动抑制试验的材料、条件、操作、质量控制、数据处理、试验报告等的基本要求。 本部分适用于为化学农药登记而进行的溞类急性活动抑制试验，其他类型的农药可参照使用。 本部分不适用于易挥发和难溶解的化学农药。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 半数抑制浓度 median effective concentration 在急性活动抑制试验中，引起50％供试生物活动受抑制时的供试物浓度，用EC50表示。 注：单位为mg a.i./L。 2.2 活动抑制 immobilisation 轻晃试验容器，溞在15 s内不能游动视为活动抑制，但允许附肢微弱活动。 2.3 供试物test substance 试验中需要测试的物质。 2.4 化学农药 chemical pesticide 利用化学物质人工合成的农药。其中有些以天然产品中的活性物质为母体，进行仿制、结构改造，创新而成，为仿生合成农药。 同义词：有机合成农药synthetic organic pesticide。 [NY/T 1667.1—2008，定义2.3.1] 2.5 原药technical material 在制造过程中得到的有效成分及杂质组成的最终产品，不能含有可见的外来物质和任何添加物，必要时可加入少量的稳定剂。 [NY/T 1667.2—2008，定义2.5.1] 2.6 制剂 formulation product 由农药原药(或母药)和助剂制成使用状态稳定的产品。 [NY/T 1667.2—2008，定义2.4] 2.7 有效成分active ingredient；a.i. 农药产品中具有生物活性的特定化学结构成分。 [NY/T l667.2—2008，定义3.1] 2.8 参比物质 reference substances 在测试中为证实或否定供试物的某种特性或判断测试系统有效性而使用的化学物质或混合物。 3试验概述 用供试物配制一系列不同浓度的试验药液，然后将试验用溞转移至试验药液中，连续48 h观察试验用溞的中毒症状与活动受抑制情况，并求出48 h的EC50值以及95％置信限。 4试验方法 4.1材料和条件 4.1.1供试生物 推荐使用大型溞(Daphnia magna Straus)，保持良好的培养条件，使大型溞的繁殖处于孤雌生殖状态。选用实验室条件下培养3代以上、出生24 h内的非头胎溞。试验用溞应是来源于同一母系的健康溞，即未表现任何受胁迫现象(如：死亡率高、出现雄溞和冬卵、头胎延迟、体色异常等)。 4.1.2供试物 供试物应使用农药制剂、原药或纯品。对难溶于水的农药，可用少量对溞类低毒的有机溶剂助溶，有机溶剂用量一般不得超过0.1 mL(g)/L。 4.1.3参比物质 参比物质为重铬酸钾(分析纯以上)。 4.1.4主要仪器设备 主要仪器设备如下： ——溶解氧测定仪； ——pH计； ——水质硬度测定仪； ——电子天平； ——移液器； ——玻璃或其他化学惰性材料制成的容器等。 4.1.5试验用水 溞类的培养、驯化及试验推荐使用重组水，若选择其他水应符合附录A的规定。重组水推荐使用ISO标准稀释水、Elendt M4培养液和Elendt M7培养液，配制方法参见附录B。Elendt M4培养液和Elendt M7培养液不能用于含有金属受试物的测试。试验期间水质应保持稳定，满足pH为6.0～9.0，溶解氧≥3.0 mg/L。对于大型溞，水质硬度(以CaCO3计)为140 mg/L～250 mg/L，对于其他溞类，可适当降低水质硬度。 4.1.6试验条件 试验水温18℃～22℃，同一试验中，温度变化应控制在±1℃之内；光照周期(光暗比)为16 h：8 h，或全黑暗条件(尤其对光不稳定的供试物)。试验期间试验容器中不应充气和调节pH，不得喂食受试溞。 4.2试验操作 4.2.1 预试验 按正式试验的条件，先将溞类暴露于较大范围浓度系列的试验药液中48 h，每一浓度放5只幼溞，可不设重复，以确定正式试验的浓度范围。 4.2.2 正式试验 在预试验确定的浓度范围内按一定比例间距(几何级差应控制在2.2倍以内)设置至少5个浓度组，并设空白对照组，如使用溶剂助溶应设溶剂对照组。每个浓度和对照均设4个重复，每个重复至少5只试验用溞，承载量为每只溞不小于2 mL。如果试验浓度少于5个，应在报告中给予合理解释。试验开始后24 h、48 h定时观察、记录每个容器中试验用溞活动受抑制数和任何异常症状或表现。 4.2.3 限度试验 设置上限浓度100 mg a.i./L，即在供试物达100 mg a.i./L时受试溞抑制率不超过10％，则无需继续试验；否则需进行正式试验。如供试物溶解度小于100 mg a.i./L，则采用最大溶解度作为上限浓度。 4.2.4参比物质试验 为检验实验室的设备、条件、方法及供试生物的质量是否合乎要求，设置参比物质作方法学上的可靠性检验。应定期(至少每季度一次)进行参比物质试验。参比物质为重铬酸钾。 4.2.5 操作要求 试验操作及试验过程中溞不能离开水，转移时要用玻璃滴管。 4.3 数据处理 4.3.1统计分析方法的选择 可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法计算每一观察时间(24 h、48 h)的溞类半抑制浓度EC50，也可采用相关统计学软件进行数据分析和计算。 4.3.2 寇氏法 用寇氏法可求出溞类在24 h和48 h的EC50值及95％置信限。 EC50的计算见式(1)： logEC50＝Xm-i(∑P-0.5) (1) 式中： Xm——最高浓度的对数； i——相邻浓度比值的对数； ∑P——各组抑制率的总和(以小数表示)。 95％置信限的计算见式(2)： 95％置信限=logEC50±1.96SlogEC50 (2) 标准误的计算见式(3)： (3) 式中： p——1个组的抑制率； q——1-p； n——各浓度组溞的数量。 4.3.3直线内插法 采用线性刻度坐标，绘制抑制百分率对试验物质浓度的曲线，求出50％活动抑制时的EC50值。 4.3.4概率单位图解法 用半对数纸，以浓度对数为横坐标、抑制百分率对应的概率单位为纵坐标绘图。将各实测值在图上用目测法画一条相关直线，从直线中读出活动抑制50％的浓度对数，估算出EC50值。 4.4质量控制 质量控制条件包括： ——对照组试验受抑制溞数不超过10％； ——试验过程中供试物浓度不低于初始浓度的80％； ——在20℃条件下，参比物质重铬酸钾对大型溞的EC50(24 h)应处于0.6 mg/L～2.1 mg/L之间； ——试验结束时对照组和试验组的溶解氧浓度不小于3.0 mg/L。 5试验报告 试验报告至少应包括下列内容： ——供试物的信息，包括供试农药的通用名、化学名称、结构式、CAS号、纯度、基本理化性质、来源等； ——供试生物的名称、来源、大小及饲养情况； ——试验条件，包括水温、光照、溶解氧、pH及水质硬度等； ——试验药液的浓度，试验开始后24 h、48 h的EC50值及95％置信限及中毒症状，并给出所采用的计算方法； ——试验质量控制条件描述； ——对溞的毒性等级划分参见附录C。 附 录 A (资料性附录) 合格试验用水的部分化学特性 合格试验用水的化学特性参见表A.1。 表A.1 合格试验用水的部分化学特性 物质 浓 度 颗粒物 <20 mg/L 总有机碳(TOC) <2 mg/L 游离氨 <1 μg/L 残留氯 <10 μg/L 总有机磷农药 <50 ng/L 总有机氯农药与多氯联苯(PCB) <50 ng/L 总有机氯 <25 ng/L 附 录 B (资料性附录) 重组水的配制 表B.1给出了ISO标准稀释水的配制方法。 表B.1 ISO标准稀释水 贮备液(单一物质) 每升ISO标准稀释水中贮备液的加入量/ mL 物质 浓度/(mg/L) CaCl2·2H2O 11 760 25 MgSO4·7H2O 4 930 25 NaHCO3 2 590 25 KCl 230 25 注：配制用水为纯水，如去离子水、蒸馏水或反向渗透水，其电导率<10 μS/cm。 表B.2和表B.3给出了Elendt M4培养液和Elendt M7培养液的配制方法。用去离子水、蒸馏水或反向渗透水(以下均简称水)分别配制贮备液I，贮备液Ⅱ、常量营养贮备液和混合维生素贮备液。制备Elendt M4培养液和Elendt M7培养液时，用贮备液I制备贮备液Ⅱ，在使用前最后加入常量营养贮备液和混合维生素贮备液。 表B.2 Elendt M4培养液和Elendt M7培养液的贮备液I、贮备液Ⅱ的配制 贮备液I (单一物质) 浓度/(mg/L) 与Elendt M4培养液 的浓度关系 为制备贮备液Ⅱ将贮备液I 加入到水中的量/(mL/L) M4 M7 H3BO3 57 190 20 000倍 1.0 0.25 MnCl2·4H2O 7 210 20 000倍 1.0 0.25 LiCl·H2O 6 120 20 000倍 1.0 0.25 RbCl 1 420 20 000倍 1.0 0.25 SrCl2·6H2O 3 040 20 000倍 1.0 0.25 NaBr 320 20 000倍 1.0 0.25 Na2MoO4·2H2O 1 260 20 000倍 1.0 0.25 CuCl2·2H2O 335 20 000倍 1.0 0.25 ZnCl2 260 20 000倍 1.0 1.0 CoCl2·6H2O 200 20 000倍 1.0 1.0 KI 65 20 000倍 1.0 1.0 表B.2(续) 贮备液I (单一物质) 浓度/(mg/L) 与Elendt M4培养液的浓度关系 为制备贮备液Ⅱ将贮备液I加入到水中的量/(mL/L) M4 M7 Na2SeO3 43.8 20 000倍 1.0 1.0 NH4VO3 11.5 20 000倍 1.0 1.0 Na2EDTA·2H2O 5 000 2 000倍 — — FeSO4·7H2O 1 991 2 000倍 — — 2L Fe-EDTA溶液 — 1 000倍 20.0 5.0 注：Na2EDTA和FeSO4两者单独制备，混在一起后立即灭菌。 表B.3 Elendt M4培养液和Elendt M7培养液的配制 组分 浓度/(mg/L) 与Elendt M4培养液的浓度关系 为制备Elendt M4培养液和Elendt M7培养液，水中加入各组分的量/(mL/L) M4 M7 贮备液Ⅱ — 20倍 50 50 常量营养 贮备液 (单一物质) CaCl2·2H2O 293 800 1 000倍 1.0 1.0 MgSO4·7H2O 246 600 2 000倍 0.5 0.5 KCl 58 000 10 000倍 0.1 0.1 NaHCO3 64 800 1 000倍 1.0 1.0 Na2SiO3·9H2O 50 000 5 000倍 0.2 0.2 NaNO3 2 740 10 000倍 0.1 0.1 KH2PO4 1 430 10 000倍 0.1 0.1 K2HPO4 1 840 10 000倍 0.1 0.1 混合维生素贮备液a — 10 000倍 0.1 0.1 注：为了避免盐沉淀，应将适量的贮备液加入到500 mL～800 mL水中，然后定容至1 L。 a混合维生素贮备液是由盐酸硫胺(维生素B1)、氰钴胺(维生素B12)和钙长石(维生素H)配制而成，浓度分别为750 mg/L、10 mg/L和7.5 mg/L。混合维生素贮备液应以较小分装冷藏保存。 附 录 C (资料性附录) 农药对溞类毒性等级划分 按对溞类活动的半数抑制浓度EC50(48 h)，将农药对溞类的急性毒性分为四个等级，见表C.1。 表C.1 农药对溞类的毒性等级划分 毒性等级 EC50(48 h)/(mg a.i./L) 剧毒 EC50≤0.1 高毒 0.110 参考文献 [1] NY/T 1667.1—2008农药登记管理术语 第1部分：基本术语 1-23 NY/T 1667.2—2008农药登记管理术语 第2部分：产品化学 [3] FAO(1989).Guidelines on environmental criteria for the registration of pesticides. Food and Agriculture Organization of the United Nations. [4] OECD(2004).Guideline 202：Daphnia sp.，Acute Immobilisation Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. [5] Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment.No.23. Paris 2000. [6]US EPA(1996).Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test，Freshwater Daphnids(OCSPP 850.1010).Ecological Effects Test Guidelines. [7]蔡道基.农药环境毒理学研究.北京：中国环境科学出版社，1999.