标准编号:	GB 5009.210-2016
中文名称:	食品安全国家标准 食品中泛酸的测定
英文名称:	National Food Safety Standard - Determination of pantothenic acid in food
行业分类:	GB    国家标准
发布机构:	中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
发布日期:	2016-08-31
实施日期:	2017-3-1
标准状态:	被替代
被新标准替代:	GB 5009.210-2023 食品安全国家标准 食品中泛酸的测定
被替代日期:	2024-9-6
替代旧标准:	GB/T 5009.210-2008 食品中泛酸的测定
翻译语言:	英文
文件格式:	PDF
中文字符数:	14000 字
翻译价格(元):	290.00 元
交付时间:	付款后 1 个工作日

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This standard replaces "Determination of Pantothenic Acid in Foods" (GB/T 5009.210-2008).



The following technical changes have been made with respect GB/T 5009.210-2008:



——the name of this standard is revised as "National Food Safety Standard - Determination of Pantothenic Acid in Foods".



——high performance liquid chromatography method is added;



——food pretreatment method is modified;



——the detection limit and quantitation limit are added.



National Food Safety Standard - Determination of Pantothenic Acid in Foods



1 Scope



This standard specifies the methods of determining pantothenic acid and calcium pantothenate in foods.



Method I in this standard is applicable to determining pantothenic acid in foods, and Method II is applicable to determining pantothenic acid in health foods and formula foods of nutrient supplement category.



Method I Microbiological Method



2 Principle



Pantothenic acid is a necessary nutrient for growth of Lactobacillus plantarum (ATCC 8014). Under certain control condition, inoculate Lactobacillus plantarum in culture solution containing sample solution, after a certain period, determine light transmittance (or absorbance), then calculate the content of pantothenic acid in the sample according to the standard curve of pantothenic acid content and light transmittance (or absorbance).



3 Reagents and Materials



Unless otherwise specified, all reagents adopted for this method are analytically pure and water is Grade II water as specified in GB/T 6682.



3.1 Reagents



3.1.1 Hydrochloric acid (HCl).



3.1.2 Glacial acetic acid (C2H4O2).



3.1.3 Sodium hydroxide (NaOH).



3.1.4 Sodium chloride (NaCl).



3.1.5 Sodium carbonate (Na2CO3).



3.1.6 Potassium bicarbonate (KHCO3).



3.1.7 Dipotassium phosphate (K2HPO4).



3.1.8 Sodium acetate trihydrate (C2H3O2Na·3H2O).



3.1.9 Monopotassium phosphate trihydrate (KH2PO4·3H2O).



3.1.10 Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O).



3.1.11 Ferrous sulfate heptahydrate (FeSO4·7H2O).



3.1.12 Manganese sulfate monohydrate (MnSO4·H2O).



3.1.13 Trihydroxymethyl aminomethane (C4H11NO3).



3.1.14 Glucose (C6H12O6).



3.1.15 Methylbenzene (C7H8).



3.1.16 Anhydrous ethanol (C2H6O).



3.1.17 Anion exchange resin Dowex 1×8: particle size 38μm~75μm.



3.1.18 Alkaline phosphatase: enzyme activity ≥23U/g.



3.1.19 Liver acetone powder, from pigeon: enzyme activity ≥0.1U/g.



3.1.20 Peptone: nitrogen content ≥10%.



3.1.21 Yeast extract: nitrogen content ≥10%.



3.1.22 Agar.



3.2 Reagent preparation



3.2.1 Acetic acid solution (0.2 mol/L): pipet 11.8 mL of glacial acetic acid, dilute it with water to 1000mL, then mix uniformly.



3.2.2 Sodium acetate solution (0.2mol/L): weigh 27.2 g of sodium acetate trihydrate, dissolve it with water, and dilute to 1000mL, then mix uniformly.



3.2.3 Hydrochloric acid solution (1mol/L): pipette 83mL of hydrochloric acid, dilute it with water to 1000mL, then mix uniformly.



3.2.4 Hydrochloric acid soak solution: pipet 100mL of hydrochloric acid to mix with 5000 mL of water.



3.2.5 Sodium hydroxide solution (1mol/L): weigh 40g of sodium hydroxide, dissolve it with water, and dilute to 1000mL, then mix uniformly.



3.2.6 Sodium hydroxide solution (0.1mol/L): weigh 4g of sodium hydroxide, dissolve it with water, and dilute to 1000mL, then mix uniformly.



3.2.7 Tris buffer solution: weigh 121.0 g of trihydroxymethyl aminomethane, dissolve it into 500mL of water, adjust the pH to 8.1 ± 0.1 with glacial acetic acid, add water to 1000mL, then mix uniformly. It may be reserved for 2 weeks in a 2℃ ~ 4℃ refrigerator.



3.2.8 Normal saline: weigh 9g of sodium chloride, dissolve it with water, and dilute to 1000mL, then mix uniformly. Conduct sterilization just before use. After 10 min of autoclaved sterilization at 121 ℃, preserve it for use.



3.2.9 Ethanol solution (20%): weigh 200 mL of anhydrous ethanol, then mix it with 800ml of water uniformly.



3.2.10 Sodium carbonate solution (0.08mol/L): weigh 8.5 g of sodium carbonate, dissolve it with water, and dilute to 1000mL, then mix uniformly.



3.2.11 Potassium bicarbonate solution (0.02mol/L): weigh 2g of potassium bicarbonate, dissolve it with water, and dilute to 1000mL, then mix uniformly.



3.2.12 Alkaline phosphatase solution: weigh 2 g of alkaline phosphatase, dissolve it with water, and diluted to 100mL. Prepare fresh solution before use, preserve it in 2℃ ~ 4℃ refrigerator for precooling.



3.2.13 Liver extract from pigeon



3.2.13.1 Activated Dowex 1×8: weigh 100g of Dowex 1×8 into a conical flask, add into 1L of hydrochloric acid solution, put it on oscillator to sufficiently shake for 10 min, filter it with Buchner funnel with filter paper. Return Dowex 1×8 to the conical flask, add into 1L of hydrochloric acid solution, repeat shaking and filtering. Add 1L of water into Dowex 1×8, shake it for 10 min, filter it, then repeat washing with water for 10 times. Add into Tris buffer solution dropwise to adjust the pH of Dowex 1×8 to 8.0 ± 0.1. Preserve it in a 2℃ ~ 4℃ refrigerator, and use it up within 2 days.



3.2.13.2 Liver extract from pigeon: put the container used into a 2℃ ~ 4℃ refrigerator for refrigeration overnight the day before preparing the reagent. Weigh 30g of liver acetone powder, from pigeon, put it inside a mortar, while keeping it in ice bath, add into 300mL of potassium bicarbonate solution in twice, grind to homogenate, then transfer it to a centrifugal tube with stopper, stopper it, then sufficiently shake it, after 10 min of refrigeration at -20℃, centrifuge it at 3000 r/min for 5 min, then transfer the supernatant to a 500mL wide-mouth bottle. Add 150 g of activated Dowex 1×8, put it inside the ice bath, mix uniformly for 5 min, pour the mixed solution into a centrifugal tube for 5min of centrifugation at 3000 r/min. Transfer the supernatant into another 500mL precooled wide-mouth bottle, after 10 min of refrigeration at -20℃, add into 150 g of activated Dowex 1×8, put it inside the ice bath, then mix uniformly for 5min, pour the mixed solution into centrifugal tube for centrifugation at 3000 r/min, put the supernatant into different test tubes with stopper (about 3mL in each tube), preserve it by freezing at -20℃. Defreeze it in 2℃ ~ 4℃ refrigerator, and preserve it until use.



3.3 Culture medium



3.3.1 Saline solution A: respectively weigh 25 g of dipotassium phosphate and 25 g of monopotassium phosphate trihydrate, dissolve it with water and dilute to 500mL, then mix uniformly. Add into 1mL of methylbenzene, it may be reserved for 1 year in a 2℃ ~ 4℃ refrigerator.



3.3.2 Saline solution B: respectively weigh 10g magnesium sulfate heptahydrate, 0.5 g of sodium chloride, 0.5 g of ferrous sulfate heptahydrate and 0.5 g of manganese sulfate monohydrate, dissolve it with water and dilute to 500mL. Add 5 drops of hydrochloric acid, and it may be reserved for 1 year in a 2℃ ~ 4℃ refrigerator.



3.3.3 Agar medium: weigh or pipet each reagent according to Table 1, add water to 100mL, mix them, heat them in boiling water bath until the agar is fully dissolved. Adjust pH to 6.8 ± 0.1 with 1mol/L hydrochloric acid solution and/or 1mol/L sodium hydroxide solution. Put it into different test tubes as soon as possible, about 3mL ~ 5mL for each test tube according to the inner diameter, the liquid level shall not be less than 2cm. Put on tampon, autoclave it at 121 ℃ for 15min. Take it out, put the test tube upright, after cooling, preserve it in refrigerator for standby.



Table 1 Preparation of Agar Medium for Strain Reserve

Reagent Consumption

Glucose 1.0g

Peptone 0.8g

Yeast extract dry powder 0.2g

Sodium acetate trihydrate 1.7g

Salt solution A 0.2mL

Salt solution B 0.2mL

Agar 1.2g



3.3.4 Culture solution for determination of pantothenic acid: culture solution for determination of pantothenic acid may be prepared according to Annex A or that with equivalent efficacy may be directly purchased from a reagent company, and prepared according to instructions before use.



3.4 Standard product



D- calcium pantothenate (C18H32CaN2O10): purity ≥99%.



3.5 Preparation of standard solution



3.5.1 Standard stock solution of pantothenic acid (40.0μg/mL): accurately weigh 43.5 mg of D-calcium pantothenate pre-dried to constant weight, dissolve it with water, then transfer it to a 1000mL volumetric flask, add 10mL of acetic acid solution and 100mL of sodium acetate solution, then dilute it with water to the scale. Store it into a brown bottle, add into 3~5 drops of methylbenzene, it may be reserved for 2 year in a 2℃ ~ 4℃ refrigerator.



3.5.2 Standard pantothenic acid intermediate solution (1.00μg/mL): accurately pipet 25.0 mL of standard pantothenic acid stock solution, put it into a 1000mL volumetric flask, add into 10mL acetic acid solution and 100mL sodium acetate solution, then dilute it with water to the scale. Add into 3~5 drops of methylbenzene, it may be reserved for 1 year in a 2℃ ~ 4℃ refrigerator.



3.5.3 Standard pantothenic acid working solution (20ng/mL): accurately pipet 2.00 mL of standard pantothenic acid intermediate solution, put it into a 100mL volumetric flask, dilute it with water to the scale, then mix uniformly. Prepare fresh solution before use.



4 Instruments and Equipment



4.1 Balance: sensibility 0.1 mg.



4.2 Thermostatic incubator: 37℃±1℃.



4.3 Pressure steam sterilizer: 121℃.



4.4 Vortex oscillator.



4.5 Centrifuger: rotation speed ≥3000r/min.



4.6 Inoculating needle and inoculating loop.



4.7 pH meter: ± 0.01 accuracy.



4.8 UV-spectrophotometer.



4.9 Superclean bench.



4.10 Ultrasonator.



5 Preparation and Preservation of Strain



5.1 Strain



Lactobacillus plantarum (ATCC 8014).



5.2 Preparation of strain for reservation



Transfer the strain Lactobacillus plantarum (ATCC 8014) to agar medium, culture in the thermostatic incubator (37℃±1℃) for 20h~24h, continuously propagate for 2~3 times. Take it out, then put it inside a 2℃ ~ 4℃ refrigerator, preserve as stocks strain. Propagate at least once each month, no more than 25 generations.



Prior to test, inoculate the stocks strain to agar medium, culture in the thermostatic incubator (37℃±1℃) for 20h~24h to activate the strains for the preparation of inoculated solution.



Note: for the stocks strain preserved for several weeks, it cannot be immediately used to prepare the inoculated solution, and prior test, continuously reproduce 2~3 generations to ensure the activity of bacteria.

Foreword i
1 Scope
2 Principle
3 Reagents and Materials
4 Instruments and Equipment
5 Preparation and Preservation of Strain
6 Analysis Procedures
7 Accuracy
8 Other
9 Principle
10 Reagents and Materials
11 Instruments and Equipment
12 Analysis Procedures
13 Expression of Analysis Results
14 Accuracy
15 Other
Annex A Preparation Method of Culture Solution for Pantothenic Acid Determination
Annex B Liquid Chromatogram of Standard Pantothenic Acid Solution

中华人民共和国国家标准
GB5009.210—2016
食品安全国家标准
食品中泛酸的测定
2016-08-31发布 2017-03-01实施
中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会 发布
前 言
本标准代替GB/T5009.210—2008《食品中泛酸的测定》。
本标准与GB/T5009.210—2008相比，主要变化如下：
——标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中泛酸的测定”;
——增加了高效液相色谱方法;
——修改了食品的前处理方法;
——增加了检出限和定量限。
食品安全国家标准
食品中泛酸的测定
1 范围
本标准规定了食品中泛酸和泛酸钙的测定方法。
本标准第一法适用于食品中泛酸的测定，第二法适用于营养素补充剂类保健食品和配方食品中泛酸(钙)的测定。
第一法 微生物法
2 原理
泛酸是植物乳杆菌Lactobacillus plantarum (ATCC8014)生长所必需的营养素，在一定控制条件下，将植物乳杆菌液接种至含有试样液的培养液中，培养一定时间后测定透光率(或吸光度值)，根据泛酸含量与透光率(或吸光度值)的标准曲线计算出试样中泛酸的含量。
3 试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。
3.1 试剂
3.1.1 盐酸(HCl)。
3.1.2 冰乙酸(C2H4O2)。
3.1.3 氢氧化钠(NaOH)。
3.1.4 氯化钠(NaCl)。
3.1.5 碳酸钠(Na2CO3)。
3.1.6 碳酸氢钾(KHCO3)。
3.1.7 磷酸氢二钾(K2HPO4)。
3.1.8 三水合乙酸钠(C2H3O2Na·3H2O)。
3.1.9 三水合磷酸二氢钾(KH2PO4·3H2O)。
3.1.10 七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)。
3.1.11 七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)。
3.1.12 一水合硫酸锰(MnSO4·H2O)。
3.1.13 三羟甲基氨基甲烷(C4H11NO3)。
3.1.14 葡萄糖(C6H12O6)。
3.1.15 甲苯(C7H8)。
3.1.16 无水乙醇(C2H6O)。
3.1.17 阴离子交换树脂Dowex1×8：粒度38μm~75μm。
3.1.18 碱性磷酸酶：酶活力≥23U/g。
3.1.19 鸽子肝脏丙酮提取物干粉(liver acetone powder, from pigeon)：酶活力≥0.1U/g。
3.1.20 蛋白胨：含氮量≥10%。
3.1.21 酵母提取物：含氮量≥10%。
3.1.22 琼脂。
3.2 试剂配制
3.2.1 乙酸溶液(0.2mol/L)：吸取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL，混匀。
3.2.2 乙酸钠溶液(0.2mol/L)：称取27.2g三水合乙酸钠，加水溶解并稀释至1000mL，混匀。
3.2.3 盐酸溶液(1mol/L)：吸取83mL盐酸，加水稀释至1000mL，混匀。
3.2.4 盐酸浸泡液：吸取100mL盐酸与50倍水混合。
3.2.5 氢氧化钠溶液(1mol/L)：称取40g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1000mL，混匀。
3.2.6 氢氧化钠溶液(0.1mol/L)：称取4g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1000mL，混匀。
3.2.7 Tris缓冲液：称取121.0g三羟甲基氨基甲烷溶于500mL水中，用冰乙酸调pH 至8.1±0.1，加水至1000mL，混匀。贮存于2℃~4℃冰箱中，可保存2周。
3.2.8 生理盐水：称取9g氯化钠，加水溶解并稀释至1000mL，混匀。临用前预先灭菌，于121 ℃高压灭菌10min后备用。
3.2.9 乙醇溶液(20%)：量取200mL无水乙醇与800mL水混匀。
3.2.10 碳酸钠溶液(0.08mol/L)：称取8.5g碳酸钠，加水溶解并稀释至1000mL，混匀。
3.2.11 碳酸氢钾溶液(0.02mol/L)：称取2g碳酸氢钾，加水溶解并稀释至1000mL。混匀。
3.2.12 碱性磷酸酶溶液：称取2g碱性磷酸酶，加水溶解并稀释至100mL。临用现配，2℃~4℃冰箱预冷。
3.2.13 鸽子肝脏提取液
3.2.13.1 活化Dowex 1×8：称取100g Dowex 1×8于锥形瓶中，加入1L盐酸溶液，置于振荡器上充分振摇10min，用铺有滤纸的布氏漏斗过滤。Dowex 1×8转回锥形瓶，再加入1L盐酸溶液重复振摇、过滤。Dowex 1×8加入1L水振摇10min，过滤，重复用水洗涤10次。逐滴加入Tris缓冲液调节Dowex 1×8pH 至8.0±0.1。2℃~4℃冰箱保存，2天内用完。
3.2.13.2 鸽子肝脏提取液：配制此试剂前一天将所用容器放入2℃~4℃冰箱中冷藏过夜。称取30g鸽子肝脏丙酮提取物干粉，放入研钵中，冰浴条件下分两次加入300mL碳酸氢钾溶液研磨至匀浆，转入具塞离心管中，盖好塞后充分振摇，-20℃冷冻10min后以3000r/min离心5min，将上清液转至500mL广口瓶中。加150g活化Dowex1×8，放入冰浴中混匀5 min，将混合液倒入离心管中，3000r/min离心5min。将上清液移入另一500mL预冷的广口瓶中，-20℃冷冻10min，再加150g活化Dowex1×8，放入冰浴中混匀5min，将混合液倒入离心管中，3000r/min离心，将上清液分装于具塞试管中(每管大约3mL)，-20℃冷冻保存。用前于2℃~4℃冰箱内化冻并保存至用时。
3.3 培养基
3.3.1 甲盐溶液：分别称取25g磷酸氢二钾和25g三水合磷酸二氢钾，加水溶解并稀释至500mL，混匀。加入1mL甲苯，2℃~4℃冰箱可保存1年。
3.3.2 乙盐溶液：分别称取10g七水合硫酸镁、0.5g氯化钠、0.5g七水合硫酸亚铁和0.5g一水合硫酸锰，加水溶解并稀释至500mL。加5滴盐酸，2℃~4℃冰箱可保存1年。
3.3.3 琼脂培养基：按表1称取或吸取各试剂，加水至100mL，混合，沸水浴加热至琼脂完全溶化。趁热用1mol/L盐酸溶液和/或1mol/L氢氧化钠溶液调节pH 至6.8±0.1。尽快分装，根据试管内径粗细加入3mL~5mL，液面高度不得低于2cm。塞上棉塞，121℃高压灭菌15min。取出后试管直立放置，待冷却后于冰箱内保存，备用。
表1 菌种储备用琼脂培养基配制一览表
试剂 用量
葡萄糖 1.0g
蛋白胨 0.8g
酵母提取物干粉 0.2g
三水合乙酸钠 1.7g
甲盐溶液 0.2mL
乙盐溶液 0.2mL
琼脂 1.2g
3.3.4 泛酸测定用培养液：可按附录A 配制泛酸测定用培养液。也可直接由试剂公司购买效力相当的泛酸测定用培养基，用前按说明书配制。
3.4 标准品
D-泛酸钙(C18H32CaN2O10)：纯度≥99%。
3.5 标准溶液的配制
3.5.1 泛酸标准储备溶液(40.0μg/mL)：精确称取43.5mg预干燥至恒重的D-泛酸钙，加水溶解并转移至1000mL 容量瓶中，加10mL乙酸溶液，100mL乙酸钠溶液，用水定容至刻度。储存于棕色瓶中，加入3滴~5滴甲苯，于2℃~4℃冰箱中可保存2年。
3.5.2 泛酸标准中间液(1.00μg/mL)：准确吸取25.0mL泛酸标准储备溶液置于1000mL容量瓶中，加入10mL乙酸溶液，100mL乙酸钠溶液，用水定容至刻度。加入3滴~5滴甲苯于2 ℃~4 ℃冰箱中可保存1年。
3.5.3 泛酸标准工作溶液(20ng/mL)：准确吸取2.00mL泛酸标准中间溶液置于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。临用前现配。
4 仪器和设备
4.1 天平：感量0.1mg。
4.2 恒温培养箱：37℃±1℃。
4.3 压力蒸汽消毒器：121℃。
4.4 漩涡振荡器。
4.5 离心机：转速≥3000r/min。
4.6 接种针和接种环。
4.7 pH 计：精度±0.01。
4.8 紫外-分光光度计。
4.9 超净工作台。
4.10 超声振荡器。
5 菌种的制备与保存
5.1 菌种
植物乳杆菌Lactobacillus plantarum (ATCC8014)。
5.2 储备菌种的制备
将菌种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum (ATCC8014)转接至琼脂培养基中，在37℃±1℃恒温箱中培养20h~24h，连续传种2次~3次。取出后放入2℃~4℃冰箱作为储备菌株保存。每月至少传代一次，不宜超过25代。
试验前将储备菌株接种至琼脂培养基中，37℃±1 ℃恒温培养箱中培养20h~24h以活化菌株，用于接种液的制备。
注：保存数周以上的储备菌株，不能立即用作接种液制备，试验前宜连续传种2代~3代以保证细菌活力。
5.3 接种液的制备
试验前一天，取2mL泛酸标准工作溶液和4mL泛酸测定用培养液混匀，分装于2支5mL离心管中，塞好棉塞，于121℃高压灭菌15min后即为种子培养液。冷却后用接种环将活化的菌株转种至2支种子培养液中，于37℃±1℃恒温培养箱中培养20h~24h。取出后3000r/min离心10min，弃上清液，无菌操作下用已预先灭菌的生理盐水淋洗2次，3000r/min离心10min，弃上清液。再加入3mL灭菌生理盐水，振荡混匀，制成接种液，立即使用。
6 分析步骤
注：所有操作均需避光进行
6.1 试样制备
谷薯类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.3mm~0.5mm);肉、蛋、坚果等用匀质器制成食糜;果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀;液体试样用前振摇混合。4℃冰箱可保存1周。
6.2 试样提取
6.2.1 直接提取法
形态为颗粒、粉末、片剂、液体的营养素补充剂或强化剂、预混料，添加了泛酸钙的配方食品或保健食品可采用直接提取法。
准确称取适量试样(m )，固体试样0.2g~2g;液态试样5g~10g，精确至0.001g，转入100mL锥形瓶中，加入80mL乙醇溶液，具塞，超声振摇提取4h以上至试样完全溶解，用水定容至100 mL(V1)。
6.2.2 酶解法
一般谷薯类、肉蛋乳类、果蔬菌藻类、豆及坚果类等食品试样宜采用酶解提取法。
6.2.2.1 水解：准确称取适量试样(m ，约含0.02mg~0.2mg泛酸)，精确至0.001g。一般谷薯类、肉类、蛋类、豆类及其制品称取1g~5g;新鲜果蔬、乳及其制品称取5g~10g。转入至100mL锥形瓶中，加10mLTris缓冲液、40mL水，振荡混匀。于121℃高压条件下水解15min。冷却至室温，转移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度(V1)，过滤。
6.2.2.2 酶解：准确吸取适量试样滤液(1.0mL~10.0mL，V2)至25mL具塞刻度试管底部，补水至10mL，加5mLTris缓冲液。在冰浴条件下，依次小心加入预冷的0.1mL碳酸氢钠溶液、0.4mL碱性磷酸酶溶液、0.2mL鸽子肝脏提取液和0.4mL水。小心混匀试管，避免混合物黏附于试管壁，加1滴甲苯，37℃±1℃温箱中温育过夜(8h以上)。加水至20mL，用冰乙酸调节pH 至4.5±0.1，加水定容至25.0mL(V3)，过滤。调节pH：吸取适量的试样酶解液(2.0mL~20.0mL，V4)于25mL具塞刻度试管中，加水至20mL，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH 至6.8±0.1，用水定容至25.0mL(V5)。
另取一试管加入5mLTris缓冲液和10mL水，同法加入碳酸氢钠溶液、碱性磷酸酶溶液、鸽子肝脏提取液酶液及温育过夜，并调节pH 至6.8±0.1，用水定容至25.0mL作为酶空白液。
注：以谷物、乳粉等为基质的配方食品如需计量基质本底泛酸含量，可采用酶解法提取。
6.3 稀释
根据试样中泛酸含量用水对试样提取液进行适当稀释(F)，使稀释后试样提取液中泛酸浓度约为20ng/mL。
6.4 测定系列管制备
所用试管使用前洗刷干净，用水煮沸30min，沥干后放入盐酸浸泡液中浸泡2h，经170℃烘3h后使用。
6.4.1 试样和酶空白系列管
取4支试管，分别加入1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL 试样提取液(Vx)，补水至5.0mL，加入5.0mL泛酸测定用培养液，混匀。另取4支试管分别加入1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL酶空白液。
6.4.2 标准系列管
取试管分别加入泛酸标准工作溶液0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00mL、3.50mL、4.00mL、4.50mL、5.00mL于试管中，补水至5.0mL，相当于标准系列管中泛酸含量为0ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng泛酸，再加入5.0mL 泛酸测定用培养液，混匀。为保证标准曲线的线性关系，应制备2套~3套标准系列管，绘制标准曲线时，以每个标准点的均值计算。
6.5 灭菌
将所有测定管塞好棉塞，于121℃高压灭菌15min。
6.6 接种和培养
待测定系列管冷却至室温后，在无菌操作条件下向每支测定管滴加接种液50μL。塞好棉塞，置于37℃±1℃恒温培养箱中培养16h~20h，直至达到最大混浊度，即再培养2h后透光率(或吸光度值)无明显变化。另准备一支标准0管(含0ng泛酸)不接种作为0对照管。
6.7 测定
将培养好的标准系列管、试样和酶空白系列管用漩涡混匀器混匀。用厚度为1cm 比色杯，于550nm处，以未接种的0对照管调节透光率为100%(或吸光度值为0)，依次测定标准系列管、试样和酶空白系列管的透光率(或吸光度值)。如果0对照管有明显的细菌增长，或者与0对照管相比，标准0管透光率在90%以下(或吸光度值在0.2以上);或标准系列管透光率最大变化量<40%(或吸光度值变化量<0.4)，说明可能有杂菌或不明来源的泛酸混入，需重做试验。
注：泛酸测定适宜的光谱范围540nm~660nm。
6.8 分析结果表述
6.8.1 标准曲线：以标准系列管泛酸含量为横坐标，每个标准点透光率(或吸光度值)均值为纵坐标，绘制标准曲线。
6.8.2 试样结果计算：从标准曲线查得试样和酶空白系列管中泛酸的相应含量(ρx)，如果每个试样的4支试样系列管中有3支以上泛酸含量在10ng~80ng范围内，且按照式(1)计算每毫升试样稀释液中泛酸浓度(ρ)，各管之间相对偏差小于15%，则可继续按式(2)或式(3)~式(5)进行结果计算，否则需重新取样测定。
试样稀释液中泛酸浓度按式(1)计算：
……………………(1)
式中：
ρ——试样稀释液中泛酸浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL);
ρx——从标准曲线上查得测定系列管中泛酸含量，单位为纳克(ng);
Vx——制备试样系列管时吸取的试样稀释液体积，单位为毫升(mL)。
采用直接提取法的试样中泛酸含量按式(2)计算：
……………………(2)
式中：
X——试样中泛酸含量，固态试样单位为毫克每百克(mg/100g)，液态试样为毫克每百毫升(mg/100mL);
——试样稀释液泛酸浓度平均值，单位为纳克每毫升(ng/mL);
V1——试样提取液的定容体积，单位为毫升(mL);
F——试样提取液稀释倍数;
m——试样质量，单位为克(g);
——换算系数。
采用酶解法的试样中泛酸含量按式(3)~式(5)计算：
……………………(3)
……………………(4)
……………………(5)
式中：
m0——酶空白液中泛酸含量，单位为纳克(ng);
——酶空白液中泛酸浓度平均值，单位为纳克每毫升(ng/mL);
25——酶空白液总体积，单位为毫升(mL);
mx——试样酶解液中泛酸含量，单位为纳克(ng);
——试样稀释液泛酸浓度平均值，单位为纳克每毫升(ng/mL);
V5——试样调pH 后的定容体积，单位为毫升(mL);
V3——试样酶解液的定容体积，单位为毫升(mL);
F——试样提取液稀释倍数;
V4——试样调pH 时吸取的酶解液体积，单位为毫升(mL);
X——试样中泛酸含量，固态试样单位为毫克每百克(mg/100g)，液态试样为毫克每百毫升(mg/100mL);
V1——试样水解液的定容体积，单位为毫升(mL);
m——试样质量，单位为克(g);
V2——试样酶解时吸取的水解液体积，单位为毫升(mL);
——换算系数。
结果如以泛酸钙计量，应乘以1.087。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
7 精密度
一般食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%;营养素补充剂和强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。
8 其他
一般食品称样量为5g时，检出限为0.03mg/100g，定量限为0.06mg/100g。营养强化剂类保健食品和配方食品称样量为2g时，检出限为0.025mg/100g，定量限0.05mg/100g。
第二法 高效液相色谱法
9 原理
利用泛酸易溶于水，在弱酸性至中性条件下(pH5.0~7.0)稳定的理化性质，试样用热水在超声波振荡下提取，经C18反相色谱柱分离，在紫外检测器检测200nm 波长处检测，根据色谱峰的保留时间及紫外光谱图定性，外标法定量，计算试样中泛酸含量。
10 试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
10.1 试剂
10.1.1 盐酸(HCl)。
10.1.2 磷酸(H3PO4)。
10.1.3 磷酸二氢钾(KH2PO4)：色谱纯。
10.1.4 七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O)。
10.1.5 乙腈(CH3CN)：色谱纯。
10.1.6 淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。
10.2 试剂配制
10.2.1 盐酸(0.1mol/L)：吸取8.3mL盐酸至1000mL 容量瓶中，加水稀释定容至刻度，混匀。
10.2.2 硫酸锌溶液(0.5mol/L)：称取14.4g七水合硫酸锌，加水溶解并定容至100mL。
10.2.3 磷酸二氢钾溶液(0.02mol/L)：称取2.722g磷酸二氢钾，加500mL水溶解，用磷酸调节pH至3.0，用水定容至1000mL，用0.45μm 滤膜过滤。
10.3 泛酸标准溶液
注：D-泛酸钙(C18H32CaN2O10)：纯度≥99%。
10.3.1 泛酸标准储备溶液(1.000mg/mL)：准确称取泛酸钙1.087g，加水溶解并转入1000mL容量瓶中，定容至刻度，混匀(4℃冰箱中可保存5d)。
10.3.2 泛酸标准中间溶液(100.0μg/mL)：准确吸取标准储备溶液10.0mL 于100mL 容量瓶中，加水定容至刻度。临用前配制。
10.3.3 泛酸标准工作溶液：分别准确吸取泛酸标准中间液1.0mL，2.0mL，4.0mL，8.0mL，16.0mL，32.0mL于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，得到浓度分别为1.0μg/mL，2.0μg/mL，4.0μg/mL，8.0μg/mL，16.0μg/mL，32.0μg/mL的泛酸标准工作溶液，临用前配制。
11 仪器和设备
11.1 天平：感量0.1mg。
11.2 恒箱培养箱：55℃±5℃。
11.3 超声波振荡器。
11.4 pH 计：精度±0.01。
11.5 高效液相色谱仪：带紫外检测器或二极管阵列检测器。
12 分析步骤
12.1 试样制备
固态试样粉碎并混合均匀;碳酸饮料需超声波去除二氧化碳，其他液态试样摇匀。
12.2 试样测定液的制备
12.2.1 营养素补充剂类保健食品
准确称取或量取适量试样(m)，精确至0.001g，一般固体试样0.2g~2g，液态试样10g~20g，置于50mL锥形瓶中，加入约30mL40℃~50℃温水超声提取20min，用水定容至刻度(V)。转入离心管3000r/min离心5min~10min，取上清液过0.45μm 滤膜，滤液待上机测定。
12.2.2 配方食品
准确称取适量试样(m)，精确至0.001g，一般固态试样约5g，液态试样约20g。置于100mL锥形瓶中，加入40℃~50℃温水至30mL。如果试样中含有淀粉，加入淀粉酶0.2g，振摇混匀，盖上瓶塞，在55℃±5℃水浴条件下，振摇酶解120min~240min。如果试样不含淀粉，直接超声提取20min。
取出试样液，冷却至室温，用0.1mol/L盐酸调节pH 至5.0±0.1，加入5mL0.5mol/L硫酸锌溶液，充分混合。转入50mL 容量瓶中，用水定容至刻度并充分混匀后，转入离心管3000r/min离心5min~10min，取上清液过0.45μm 滤膜，滤液待上机测定。
12.3 稀释
必要时，试样测定液用水进行适当的稀释(F)，使试样测定液中泛酸浓度在1μg/mL~32μg/mL范围内。
12.4 参考液相色谱条件
12.4.1 色谱柱：ODS-C18(粒径5μm，250mm×4.6mm)或具有同等性能的色谱柱。
12.4.2 柱温：28℃±0.5℃。
12.4.3 紫外检测器：检测波长：210nm。
12.4.4 流动相：0.02mol/L磷酸二氢钾溶液+乙腈=95+5。
12.4.5 流速：1.0mL/min。
12.4.6 进样量：10μL或20μL。
12.5 测定
12.5.1 标准曲线测定
按照已经确立的色谱条件，将泛酸标准工作液依次进行色谱分析(标准色谱图见附录B)，记录标准出峰时间、色谱峰高(或峰面积)。以标准工作液浓度为横坐标，峰高(或峰面积)为纵坐标，绘制标准曲线。
12.5.2 试样溶液的测定
取试样测定液按照色谱条件进行色谱分析，根据试样峰高(或峰面积)从标准曲线中查得相应的泛酸浓度(ρ)。
13 分析结果的表述
试样中泛酸的含量按式(6)计算：
……………………(6)
式中：
X——试样中泛酸含量，固态试样单位为毫克每百克(mg/100g)，液态试样为毫克每百毫升(mg/100mL);
ρ——从标准曲线上查得试样测定液中泛酸的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
V——试样测定液总体积，单位为毫升(mL);
F——试样测定液稀释倍数;
m——试样质量，单位为克(g);
——换算系数。
结果如以泛酸钙计量，应乘以1.087。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
14 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。
15 其他
当称样量为5g时，检出限为0.025mg/100g，定量限为0.08mg/100g。
附 录 A
泛酸测定用培养液的配制方法
A.1 试剂
A.1.1 盐酸(HCl)。
A.1.2 氢氧化钠(NaOH)。
A.1.3 活性炭：粒度为0.05mm~0.074mm。
A.1.4 甲苯(C7H8)。
A.1.5 硫酸腺嘌呤(C10H10N10·H2SO4)。
A.1.6 盐酸鸟嘌呤(C5H5N5O5·HCl)
A.1.7 尿嘧啶(C4H4N2O2)。
A.1.8 L-胱氨酸(C6H12N2O4S2)。
A.1.9 L-色氨酸或DL-色氨酸(C11H12N2O2)。
A.1.10 核黄素(C17H20N4O6)。
A.1.11 盐酸硫胺素(C12H17ClN4OS·HCl)。
A.1.12 生物素(C10H16N2O3S)。
A.1.13 乙酸(C2H4O2)溶液：0.02mol/L。
A.1.14 对氨基苯甲酸(C7H7NO2)。
A.1.15 尼克酸(C6H5NO2)。
A.1.16 盐酸吡哆醇(C8H11NO3·HCl)。
A.1.17 无水乙醇(C2H5OH)。
A.1.18 乙醇溶液(1+3)。
A.1.19 聚山梨酯-80(吐温-80)。
A.1.20 无水葡萄糖(C6H12O6)。
A.1.21 三水合乙酸钠(C2H3O2Na·3H2O)。
A.1.22 无维生素酪蛋白(vitamin free casein)。
A.2 试剂配制
A.2.1 氢氧化钠溶液(10mol/L)：称取40g氢氧化钠，用100mL水溶解。
A.2.2 氢氧化钠溶液(1mol/L)：称取4g氢氧化钠，用100mL水溶解。
A.2.3 盐酸溶液(3mol/L)：吸取250mL盐酸，用水稀释至1000mL，混匀。
A.2.4 盐酸溶液(1mol/L)：按3.2.3配制。
A.2.5 酪蛋白液：称取50g无维生素酪蛋白于500mL 烧杯中，加200mL 盐酸溶液(3mol/L)，于121℃高压水解6h。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200mL水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以除去盐酸。用10mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 至3.5±0.1。加20g活性炭，振摇约20min，过滤。重复活性炭处理2次~4次，直至滤液呈淡黄色或无色。滤液加水稀释至1000mL，加3mL甲苯，置2℃~4℃冰箱中可保存1年。
注：每次蒸发时不可蒸干或焦糊，以避免所含营养素破坏。可直接由试剂公司购买效力相当的酸水解无维生素酪蛋白。
A.2.6 腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液：分别称取硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤和尿嘧啶各0.1g于250mL烧杯中，加75mL水和2mL盐酸，加热使其完全溶解后冷却。若有沉淀产生，再加盐酸数滴，加热，如此反复直至冷却后无沉淀产生为止。用水稀释至100mL，加3滴~5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，置2℃~4℃冰箱中可保存1年。
A.2.7 胱氨酸-色氨酸溶液：分别称取4gL-胱氨酸和1gL-色氨酸或2gDL-色氨酸于800mL水中，加热至70℃~80℃，逐滴加入3mol/L盐酸溶液，不断搅拌，直至完全溶解为止。冷却至室温后加水稀释至1000mL。加3滴~5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，于2℃~4℃冰箱中可保存1年。
A.2.8 维生素液Ⅰ：分别称取20 mg 核黄素和10 mg 盐酸硫胺素，加入1.0 mL 生物素溶液(40μg/mL)，用0.02mol/L乙酸溶液溶解并定容至1000mL。加入3滴~5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，2℃~4℃冰箱可保存1年。
A.2.9 维生素液Ⅱ：分别称取10mg对氨基苯甲酸、50mg尼克酸和40mg盐酸吡哆醇，溶于1000mL乙醇溶液中。加入3滴~5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，2℃~4℃冰箱可保存1年。
A.2.10 聚山梨酯-80溶液：将25g聚山梨酯-80用乙醇溶解并稀释至250mL。2℃~4℃冰箱可保存1年。
A.2.11 泛酸测定用培养液：配制1000mL培养液，按表A.1吸取液体试剂，混合后加水300mL，依次加入固体试剂，煮沸搅拌2min。用1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L 盐酸溶液调节基础培养液pH 至6.8±0.1。加入乙盐溶液20mL，用水补至1000mL。配制时可根据培养液用量按比例增减。临用现配。
表A.1 泛酸测定用培养液配制一览表
试剂 用量
液体试剂 酪蛋白液 100mL
腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液 20mL
维生素溶液Ⅰ 20mL
维生素溶液Ⅱ 20mL
胱氨酸-色氨酸溶液 100mL
聚山梨酯-80溶液 1mL
甲盐溶液 20mL
固体试剂 无水葡萄糖 40g
三水合乙酸钠 33g
附 录 B
泛酸标准溶液的液相色谱图
泛酸标准溶液的液相色谱图见图B.1。

吸光度
图B.1 泛酸标准溶液的液相色谱图