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GB/T 19495 consists of the following parts, under the general title of Detection of genetically modified organisms and derived products:
——GB/T 19495.1 Detection of genetically modified organisms and derived products—General requirements and definitions;
——GB/T 19495.2 Detection of genetically modified organisms and derived products—General requirements for laboratories;
——GB/T 19495.3 Detection of genetically modified organisms and derived products—Nucleic acid extraction;
——GB/T 19495.4 Detection of genetically modified organisms and derived products—Qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods;
——GB/T 19495.5 Detection of genetically modified organisms and derived products—Quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods;
——GB/T 19495.6 Detection of genetically modified organisms and derived products—Gene-chip detection;
——GB/T 19495.7 Detection of genetically modified organisms and derived products—Methods for sampling and sample preparation;
——GB/T 19495.8 Detection of genetically modified organisms and derived products—Protein based methods;
——GB/T 19495.9 Detection of genetically modified organisms and derived products—Liquid bead array detection for plant products.
This part is Part 4 of GB/T 19495.
This part is developed in accordance with the rules given in GB/T 1.1-2009.
This part replaces GB/T 19495.4-2004 Detection of genetically modified organisms and derived products—Qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods. In addition to editorial changes, the following main technical changes have been made with respect to GB/T 19495.4-2004:
——Detection methods for plant endogenous genes are added;
——Detection methods for screening genes of transgenic plants are added;
——Detection methods for structural genes are deleted and detection methods for strain specificity of crops such as soybean, maize, rape seeds, cotton, rice, potato, flax, sugar beet, etc. are added.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent rights. The issuing body of this document shall not be responsible for identifying any or all such patent rights.
This part was proposed by and is under the jurisdiction of the National Technical Committee on Plant Quarantine of Standardization Administration of China (SAC/TC 271).
The previous edition replaced by this part is as follows:
——GB/T 19495.4-2004.
Detection of genetically modified organisms and derived products—
Qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods
1 Scope
This part of GB/T 19495 specifies the instruments and apparatus, reagents and materials, detection procedures, quality control, contamination-proof measures and minimum limit of detection of methods related to the screening of transgenic components and strain detection in plants and their processed products by qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods.
This part is applicable to transgenic screening and detection of plants such as soybean, maize, rape, rice, cotton, potato, flax, beet, alfalfa, tomato, papaya, apple, endive, bentgrass, nicotiana tabacum, plum, muskmelon, wheat, eggplant and eucalyptus, and is also applicable to the detection for strain specificity of plants such as soybean, maize, rape, cotton, rice, potato, flax, sugar beet and papaya.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
GB/T 6682 Water for analytical laboratory use—Specification and test methods
GB/T 19495.2 Detection of genetically modified organisms and derived products—General requirements for laboratories
GB/T 19495.3 Detection of genetically modified organisms and derived products—Nucleic acid extraction
GB/T 19495.7 Detection of genetically modified organisms and derived products—Methods for sampling and sample preparation
GB/T 27403 Criterion on quality control of laboratories—Molecular biological testing of food
3 Terms, definitions and abbreviations
3.1 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1.1
transgene
technique in which a functional DNA sequence possessed by or derived from a species is bioengineered to be transcribed or expressed in the species in order to obtain a new trait of the species
3.1.2
real-time PCR
real-time polymerase chain reaction method in which a polymerase chain reaction system needs to add a fluorescent group whose fluorescence signal monitoring the entire PCR process in real time, and the unknown template is quantitatively analyzed by a standard curve
Note: The strength of the fluorescent signal directly reflects the number of templates.
3.1.3
endogenous gene
gene with constant copies and no allele changes were detected in the tested species
Note: This gene can be used to determine species specificity.
3.1.4
exogenous gene
other biological genes transferred using bioengineering techniques
Note: After transferring to an exogenous gene, the biological variety exhibits new biological traits.
3.1.5
cycle threshold
the number of cycles experienced by the fluorescent signal in each reaction tube reaching a set threshold
3.2 Abbreviations
For the purposes of this document, the following abbreviations apply.
Alfalfa-Acc: Alfalfa Acetyl-CoA carboxylase
BAR: Phosphinothricin acetyl-transference gene
bp: Base pair
CP4-EPSPS: Agrobacterium tumefaciens strain CP4 product: herbicide tolerant form of 5-enolpyruvulshikimate-3-phosphate synthase
Cry IA(c): Bacillus thuringiensis (Bt) subsp. Kurstaki crystal protein IA(c)
Cry3A: Bacillus thuringiensis (Bt) subsp. Tenebrionis crystal protein 3A
CTAB: Cetyhrithylammonium bromide
DNA: Deoxyribonucleic acid
dATP: Deoxyadenosinc triphosphate
dCTP: Deoxyeytidine triphosphate
dGTP: Deoxyguanosine triphosphate
dNTP: Deoxyribonucleosidc triphosphate
dUTP: Deoxyuridine triphosphate
EDTA: Ethylene diaminetetraacetic acid
EPSPS: 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene
GAG56: One of 7-gliadin genes
GLuA3: Rice glutelin gene
GOX: Glyphosate oxidoreductase gene
LAT52: Pollen specific protein LAT52 gene
Lectin: Plant lectin gene
NPT II: Neomycin-3'-phosphotransferase gene
PAT: Phosphinothricin acetyltransferase gene
PCR: Polymerase chain reaction
PLD: Phospholipase D family gene
PMI: Phosphomannose-isomerase gene
pCaMV 35S: 35S promoter from cauliflower mosaic virus
pFMV 35S: 35S promoter from a modified figwort mosaic virus
pNOS: Promoter of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens
pSSuAra: The small subunit promoter of Arabidopsis
pTA29: Developmentally regulated pro-rooter from anther-specific TA29 gene from Nicotiana tabacum
pUbi: Promoter of maize Ubiquitin
SAH7: Sinapis arabidopsis homolog 7 gene
SDS: Sodium dodecylsulfate
SPS: Sucrose phosphate synthase gene
Taq: Taq DNA polymerase
TE: Tris-HCl, EDTA buffer
tE9: A terminator derived from the pea ribulose bisphosphate carboxylase gene
Tris: Tris (hydroxymethyl) aminomethane
T97: Transglutaminase 7 gene
tNOS: Terminator of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens
tOCS: Terminator of octopine synthase
t35S: Cauliflower mosaic virus 35 teminator
UDG: Uracil DNA glycosylase
UGPase: UDP-glucose pyroph08phorylase gene from Solanum tuberosum
UNG enzyme: Uracil-N-glycosylase
Wx012: Waxy wheat genes
zSSII b: The endosperm-specific SS (starch synthasc) II b
18S rRNA: 18S ribosomal RNA
4 Principle
After extracting the sample DNA, real-time PCR technology was used to screen and detect the sample DNA, and the results of real-time PCR amplification were used to determine whether the sample contained transgenic ingredients. For samples that are positive for the detection of exogenous gene, or samples that are known to be positive for transgenes, if further strain identification is required, real-time PCR detection of the strain-specific fragments will be performed. Then the results were used to determine which of the transgenic strain(s) was(were) contained in the sample.
5 Instruments and apparatus, and reagents
5.1 Instruments and apparatus
5.1.1 Real-time PCR instrument.
5.1.2 Sample crusher or grinder.
5.1.3 Balance: with a sensibility of 0.01g.
5.1.4 Water bath or thermostat incubator.
5.1.5 Refrigerated centrifuge.
5.1.6 Autoclave.
5.1.7 Vortex oscillator.
5.1.8 Biological safety cabinet.
5.1.9 pH meter.
5.1.10 Nucleic acid protein analyzer or ultraviolet spectrophotometer.
5.1.11 Micropipettes (2 μL, 10 μL, 100 μL, 200 μL, 1 000 μL).
5.2 Main reagents
Unless otherwise specified, all reagents shall be analytical or biochemical reagents, and the experimental water shall meet the specifications of Class I water in GB/T 6682.
Foreword i
1 Scope
2 Normative references
3 Terms, definitions and abbreviations
4 Principle
5 Instruments and apparatus, and reagents
6 Procedure
7 Result judgment
8 Expression of results
9 Contamination-proof measures
10 Minimum limit of detection
Annex A (Informative) Primers and probes for screening and detection of transgenic ingredients by real-time PCR
Annex B (Informative) Primers and probes for detection of transgenic plant strain specificity by real-time PCR
ICS 65.020.01
B 16
中华人民共和国国家标准
GB/T 19495.4—2018
代替GB/T 19495.4—2004
转基因产品检测
实时荧光定性聚合酶链式反应(PCR)
检测方法
Detection of genetically modified organisms and derived products—
Qualitative real-time polymerase chain reaction(PCR)methods
2018—09—17发布 2019—04—01实施
国家市场监督管理总局
中国国家标准化管理委员会
发布
前 言
GB/T 19495《转基因产品检测》分为如下几部分：
——GB/T 19495.1转基因产品检测 通用要求和定义；
——GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求；
——GB/T 19495.3转基因产品检测 核酸提取纯化方法；
——GB/T 19495.4 转基因产品检测 实时荧光定性聚合酶链式反应(PCR)检测方法；
——GB/T 19495.5转基因产品检测 实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法；
——GB/T 19495.6转基因产品检测 基因芯片检测方法；
——GB/T 19495.7转基因产品检测 抽样和制样方法；
——GB/T 19495.8转基因产品检测 蛋白质检测方法；
——GB/T 19495.9转基因产品检测 植物产品液相芯片检测方法。
本部分为GB/T 19495的第4部分。
本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本部分代替GB/T 19495.4—2004《转基因产品检测核酸定性PCR检测方法》。与GB/T 19495.4—2004相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下。
——增加了植物内源基因的检测方法；
——增加了转基因植物筛选基因的检测方法；
——删除了结构基因检测方法，增加了大豆、玉米、油菜籽、棉花、水稻、马铃薯、亚麻和甜菜等作物的品系特异性检测方法。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本部分由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口。
本部分所代替标准的历次版本发布情况为：
——GB/T 19495.4—2004。
转基因产品检测
实时荧光定性聚合酶链式反应(PCR)
检测方法
1 范围
GB/T 19495的本部分规定了植物及其加工产品中转基因成分筛选和品系检测实时荧光定性聚合酶链式反应(PCR)检测方法有关的仪器设备、试剂和材料、检测步骤、质量控制、防污染措施以及方法的最低检出限。
本部分适用于大豆、玉米、油菜、水稻、棉花、马铃薯、亚麻、甜菜、苜蓿、番茄、木瓜、苹果、菊苣、剪股颖、烟草、李子、甜瓜、小麦、茄子和桉树等植物转基因筛选检测，也适用于大豆、玉米、油菜、棉花、水稻、马铃薯、亚麻、甜菜和木瓜等植物的品系特异性检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2转基因产品检测 实验室技术要求
GB/T 19495.3转基因产品检测 核酸提取纯化方法
GB/T 19495.7转基因产品检测 抽样和制样方法
GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1
转基因transgene
将物种本身具有的或来源于其他物种的功能DNA序列，通过生物工程技术，使其在该物种中进行转录或表达，以便使该物种获得新的品种特征的技术。
3.1.2
实时荧光PCR real-time polymerase chain reaction
实时荧光聚合酶链式反应。在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，并通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
注：荧光信号的强弱直接反映模板数量。
3.1.3
内源基因endogenom gene
在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。
注：该基因可用于判定物种特异性。
3.1.4
外源基因 exogenous gene
利用生物工程技术转入的其他生物基因。
注；转入外源基因后。该生物品种表现新的生物学性状.
3.1.5
Ct值 cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Alfalfa-Acc：苜蓿乙酰辅酶a羧化酶(Alfalfa Acetyl-CoA carboxylase)
BAR：磷化麦黄酮乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyltranSferase gene)
bp：碱基对(base pair)
CP4-EPSPS：农根菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(Agrobacterium tumefaciens strain CP4 Product：herbicide tolerant form of 5-enolpyruvulshikimate-3-phosphate synthase)
Cry I A(c)：苏云晶芽饱杆菌杀虫蛋门Cry I A(c)基因[Bacillus thuringiensis(Bt)subsp. Kurstaki crystal protein I A(c)]
Cry3A：苏云晶芽孢杆菌杀虫蛋白Cry3A基因[Bacillus thuringiensis(Bt)subsp.Tenebrionis crystal protein 3A]
CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyhrithylammonium bromide)
DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dATP：脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinc triphosphate)
dCTP：脱氧胞苷三磷酸(deoxyeytidine triphosphate)
dGTP：脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)
dNTP：脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidc triphosphate)
dUTP：脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate)
EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)
EPSPS：5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene)
GAG56：一种醇溶蛋白基因(one of 7-gliadin genes)
GLuA3：大米谷蛋白基因(rice glutelin gene)
GOX：草甘膦氧化还原酶基因(glyphosate oxidoreductase genc)
LAT52：花粉特异蛋白LAT52基因
Lectin：植物凝集素基因
NPT Ⅱ：新霉素-3′-磷酸转移酶基因(neomycin-3′-phosphotransferase gene)
PAT：草丁膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase gene)
PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
PLD：磷脂酶D家族基因(phospholipase D family gene)
PMI：6-磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannose-isomerase gene)
pCaMV 35S：花椰菜花叶病毒35S启动子(35S promoter from cauliflower mosaic virus)
pFMV 35S：玄参花叶病毒35S启动子(35S promoter from a modified figwort mosaic virus)
pNOS：来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子(promoter of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens)
pSSuAra：来自拟南芥的小亚基启动子(the small subunit promoter of Arabidopsis)
pTA29：来源于烟草的花蕊特异性TA29基因的发育调节启动子(developmentally regulated pro-rooter from anther-specific TA29 gene from Nicotiana tabacum)
pUbi：玉米泛素基因的启动子(promoter of maize Ubiquitin)
SAH7：类拟兰芥属同源序列7的棉花内源基因(sinapis arabidopsis homolog 7 gene)
SDS：十二烷基磺酸钠(sodium dodecylsulfate)
SPS：蔗糖磷酸盐合成酶基因(sucrose phosphate synthase gene)
Taq：DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)
TE：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸二钠缓冲液(Tris-HCl、EDTA buffer)
tE9：为来源于豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子
Tris：三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]
t97：谷氨酰胺转移酶7基因(transglutaminase 7gene)
tNOS：来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(terminator of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens)
tOCS：章鱼碱合成酶终止子(terminator of octopine synthase)
t35S：花椰菜花叶病毒终止子(Cauliflower mosaic virus 35 teminator)
UDG：尿嘧啶DNA-糖基酶(uracil DNA glycosylase)
UGPase：马铃薯UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(UDP-glucose pyroph08phorylase gene from Solanum tuberosum)
UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶(uracil-N-glycosylase)
Wx012：小麦蜡质基因(waxy wheat genes)
zSSⅡ b：玉米淀粉合成酶b亚基[the endosperm-specific SS(starch synthasc)Ⅱ b]
18S rRNA：真核生物核糖体小亚基18S基因(18S ribosomal RNA)
4方法原理
提取样品DNA后，通过实时荧光PCR技术对样品DNA进行筛选检测，根据实时荧光PCR扩增结果.判断该样品中是否含有转基因成分。对外源基因检测结果为阳性的样品，或已知为转基因阳性的样品.如需进一步进行品系鉴定，则对品系特异性片段进行实时荧光PCR检测，根据结果判定该样品中含有哪(些)种转基因品系成分。
5仪器设备和试剂
5.1 仪器设备
5.1.1实时荧光PCR仪。
5.1.2样品粉碎仪或研磨机。
5.1.3天平：感量0.01 g。
5.1.4水浴锅或恒温孵育器。
5.1.5冷冻离心机。
5.1.6高压灭菌锅。
5.1.7涡旋振荡器。
5.1.8生物安全柜。
5.1.9 pH计。
5.1.10核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
5.1.11 微量移液器(2 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL)。
5.2主要试剂
除特别说明外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。
5.2.1实时荧光PCR预混液
为Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、PCR反应缓冲液、MgCl2(3 mmol/L～7 mmol/L)、dNTPs(含dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG酶等混合配制的溶液。
5.2.2 ROX
荧光校正试剂(50×，使用时稀释至1×)。
5.2.3引物和探针
5.2.3.1筛选检测引物探针
筛选检测基因的引物和探针参照附录A中表A.1的序列合成，加超纯水配制成100μmol/L储备液，实时荧光PCR扩增的引物和探针工作液浓度为10μmol/L。
5.2.3.2 品系特异性检测引物探针
根据需要检测的转基因植物品系，参照附录B中表B.1的序列合成引物和探针，加超纯水配制成100 μmol/L储备液，实时荧光PCR扩增的引物和探针工作液浓度为10 μmol/L。
6检测步骤
6.1取样和制样
按照GB/T 19495.7中规定的方法执行。
6.2样品DNA的提取与纯化
按照GB/T 19495.3的方法或采用具有相同效果的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。每个样品应制备2个测试样品提取DNA(提取平行重复)。
6.3 DNA浓度测定和定量
按照GB/T 19495.3中规定的方法执行。
6.4实时荧光PCR检测
6.4.1 转基因成分筛选检测基因的选择
对于未知是否为转基因产品的样品.按照表1选用筛选基因进行检测。
表1转基因筛选检测基因选用
物种 选用基因
大豆及其加工品 内源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，BAR，PAT，GOX.CP4-EPSPS，CTP2-CP4-EPSPS，tE9
玉米及其加工品 内源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ，BAR，PAT，GOX，CP4-EPSPS，CTP2-CP4-EPSPS，Cry3A，tCaMV 35S，PMI，Cry I A(b)，CRY I A(c)，pRice-Eactin
表1(续)
物种 选用基因
油菜及其加工品 内源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS.NPT Ⅱ，BAR，PAT，GOX，CP4-EPSPS，CTP2-CP4-EPSPS，pNOS，pSSuAra，pTA29，tCaMV 35S，tE9，tOCS，tg7
水稻及其加工品 内源基因，pCoMV 35S，tNOS，BAR，Cry I A(b)，CRY I A(c)
棉花及其加工品 内源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ，BAR，PAT，CP4-EPSPS，pUbi，tE9，Cry I A(b)，CRY I A(c)
马铃薯及其加工品 内源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ，CP4-EPSPS，Cry3A，pNOS
亚麻及其加工品 内源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ
甜菜及其加工品 内源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ，PAT，CP4-EPSPS，CTP2-CP4-EPSPS
苜蓿及其加工品 内源基因，pFMV 35S，CTP2-CP4-EPSPS，tE9
番茄 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPTⅡ，CRY I A(c)
苹果 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ
菊苣 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，BAR，NPT Ⅱ
剪股颖 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，CP4-EPSPS
烟草 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ
李子 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ
甜瓜 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ
木瓜 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ
小麦 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，CP4-EPSPS
茄子 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ，CRY I A(c)
桉树 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NFT Ⅱ
6.4.2实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系配制见表2。每个样品设置2个平行重复。
表2实时荧光PCR检测体系
名称 储液浓度 终浓度
10×PCR缓冲液 10× 1×
MgCl2 25 mmol/L 2.5 mmol/L
dNTP(含dUTP) 2.5 mmol/L 0.2 mmol/L
UNG酶 5 U/μL 0.075 U/μL
上游引物 10 μmol/L 见表A.1、表B.1
下游引物 10 μmol/L 见表A.1、表B.1
探针 10 μmol/L 见表A.1、表B.1
Taq酶 5 U/μL 0.05 U/μL
表2(续)
名称 储液浓度 终浓度
DNA模板 50 ng～250 ng
超纯水 补足至25μL
注1：可选用含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTP和Taq藩等成分的基于Taqman探针的实时荧光PCR预混液进行实时荧光PCR扩增。
注2：ROX荧光试剂仅在具有ROX校正通道的实时荧光PCR仪上进行扩增时添加，否则用超纯水补足。
注3：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。
6.4.3实时荧光PCR反应程序
实时荧光PCR反应参数为：50℃/2 min；95℃/10 min，95℃/15 s，60℃/60 s，40个循环。
注：95℃/10 min的专门适用于化学变构的热启动Taq酶，以上参数可根据不同塑号实时荧光PCR仪和所选PCR扩增试剂体系不同作调整。
6.4.4仪器检测通道的选择
将PCR反应管或反应板放入实时荧光PCR仪后，设置PCR反应荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。
6.4.5实验对照的设立
实验设置如下对照：
——阳性对照，为目标转基因植物品系基因组DNA，或含有上述片段的质粒标准分子DNA；
——阴性对照，相应的非转基因植物样品DNA；
——空白对照，设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照(以双蒸水代替样品)，二是PCR反应的空白对照(以双蒸水代替DNA模板)。
7结果判定
7.1 质量控制
下述指标有一项不符合者，需重新进行实时荧光PCR扩增。
——空白对照：内源基因检测Ct值≥40，外源基因或品系特异性检测Ct值≥40；
——阴性对照：内源基因检测Ct值≤30，转化事件特异性检测Ct值≥40；
——阳性对照，内源基因检测Ct值≤30，转化事件特异性检测Ct值≤35。
7.2 结果判定
测试样品外源基因检测Ct值≥40，内源基因检测Ct值≤30，则可判定该样品不含所检基因或品系。
测试样品外源基因检测Ct值≤35，内源基因检测Ct值≤30，判定该样品含有所检基因或品系。
测试样品外源基因检测Ct值在35～40，应调整模板浓度，重做实时荧光PCR。再次扩增后的外源基因检测Ct值仍在35～40，则可判定为该样品含有所检基因或品系。再次扩增后的外源基因检测Ct值≥40，则可判定为该样品不含所检基因或品系。
8结果表述
结果为阳性的，表述为“检出×××外源基因”或“检出×××转基因品系”。
结果为阴性的，表述为“未检出×××外源基因”或“未检出×××转基因品系”。
对于核酸无法有效提取的样品，检测结果为“未检出核酸成分”。
9防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403和GB/T 19495.2中的规定执行。
10最低检出限
各基因片段的实时荧光PCR扩增的最低检出限(LOD)为0.01％。
附 录A
(资料性附录)
转基因成分筛选检测实时荧光FCR引物和探针
转基因成分筛选检测用引物探针序列见表A.1。
表A.1 转基因成分筛选检测实时荧光PCR引物和探针序列信息表
序号 基因/品系名称 引物/探针序列(5′-3′) 终浓度
nmol/L 产物大小
bp 适用范围
1 18S rDNA F cctgagaaacggctacca 400 65 植物内源基因
R cgtgtcaggattgggtaat 400
P FAM-tgcgcgcctgctgccttcct-BHQ1 200
2 HMGI/Y F ggtcgtcctcctaaggcgaaag 400 99 油菜内源基因
R cttcttcggcggtcgtccac 400
P FAM-cggagccactcggtgccgcsactt-BHQ1 200
3 CruA F ggccagggtttccgtgat 200 101
R ccgtcgttgtagaaccattgg 200
P FAM-agtccttatgtgctccactttctggtgca-BHQ1 200
4 adh1 F cgtcgtttcccatctcttcctcc 300 135 玉米内源基因
R ccactccgagaccctcagtc 300
P FAM-aatcagggctcattttctcgctcctca-BHQ1 200
5 zSSⅡb F ctcccaatcctttgacatctgc 500 151
R tcgatttctctcttggtgacagg 500
P FAM-agcaaagtcagagcgctgcaatgca-TAMRA 200
6 Lectin F cctcctcgggaaagttacaa 150 74 大豆内源基因
R gggcatagaaggtgsagtt 150
P FAM-ccctcgtctcttggtcgcgccctct-BHQ1 50
7 Lectin-KVM F cacctttctcgcaccaattgaca 200 104
R tcaaactcaacagcgacgac 200
P FAM-ccacaaacacatgcaggttatcttgg-BHQ1 200
8 LAT52 F agaccacgagaacgatatttgc 400 92 番茄内源基因
R ttcttgccttttcatatccagaca 400
P FAM-ctctttgcagtcctcccttgggct-BHQl 200
9 SPS F cacctttctcgcaccaattgaca 200 104 水稻内源基因
R tcaaactcaacagcgacgac 200
P FAM-tccgagccgtccgtgcgtc-BHQ1 200
表A.1(续)
序号 基因/品系名称 引物/探针序列(5′-3′) 终浓度
nmol/L 产物大小
bp 适用范围
10 PLD F tggtgagcgttttgcagtct 200 64 水稻内源基因
R ctgatccactagcaggaggtcc 200
P FAM-tgttgtgctgccaatgtggcctg-BHQ1 200
11 GOS F tggtgagcgttttgcagtct 200 67
R ctgatccactagcaggaggtcc 200
P FAM-tgttgtgctgccaatgtggcctg-BHQ1 200
12 UGPase F ggacatgtgaagagacggagc 400 88 马铃薯内源基因
R cctacctctacccctccgc 400
P FAM-ctaccaccattacctcgcacctcctca-BHQ1 200
13 SAH7 F agtttgtaggttttgatgttacattgag 350 115 棉花内源基因
R gcatctttgaaccgcctactg 250
P FAM-aaacataaaataatgggaacaaccatgacatgt-BHQ1 175
14 GLuA3 F gacctccatattactgaaaggaag 150 121 甜菜内源基因
R gagtaattgctccatcctgttca 150
P FAM-ctacgaagtttaaagtatgtgccgctc-BHQ1 100
15 GAG56 F caacaattttctcagccccaaca 200 121 小麦属内源基因
R tcttgcatgggttcacctgtt 200
P FAM-ttcccgcagccccaacaaccgc-BHQ1 200
16 Wx012 F gtcgcgggaacagaggtgt 500 102 小麦种内源基因
R ggtgttcctccattgcgaaa 500
P FAM-caaggcggccgaaataagttgcc-BHQ1 200
17 Alfalfa-Acc F gatcagtgaacttcgcaaagtac 400 90 苜蓿内源基因
R caacgacgtgaacactacaac 400
P FAM-tgaatgctcctgtgatctgcccatgc-TAMRA 200
18 CHY F ccatgcggatcctccca 500 74 木瓜内源基因
R catcgtagccattgtaacactagctaa 500
P FAM-ttcccttcatccattcccactcttgaga-BHQ1 200
19 pCaMV 35S F gcctctgccgacagtggt 100 82 转基因大豆、玉米、油菜、棉花、水稻、番茄、马铃薯、番木瓜等外源筛选基因
R aagacgtggttggaacgtcttc 100
P FAM-caaagatggacccccacccacg-BHQ1 100
表A.1(续)
序号 基因/品系名称 引物/探针序列(5′-3′) 终浓度
nmol/L 产物大小
bp 适用范围
20 pFMV 35S F cgaagacttaaagttagtgggcatct 400 79 转基因大豆、油菜、马铃薯、番茄、玉米、棉花和苜蓿等筛选检测
R ttttgtctggtccccacaa 400
P FAM-tgaaagtaatcttgtcaacatcgagcagctgK-RHQ1 200
21 tNOS F atcgttcaaacatttggca 400 165 转基因大豆、玉米、水稻、油菜、棉花、小麦、番茄、马铃薯、番木瓜等筛选检测
R attgcgggactctaatcata 400
P FAM-catcgcaagaccggcaacagg-BHQ1 200
22 NPTⅡ F aggatctcgtcgtgacccat 400 183 转基因油菜、棉花、玉米、甜菜、番茄、马铃薯、番木瓜等筛选检测
R gcacgaggaagcggtca 400
P FAM-cacccagccggccacagtcgat-BHQ1 200
23 BAR F acaagcacggtcaacttcc 400 175 转基因油菜、玉米、小麦、棉花、水稻、大豆等筛选检测
R actcggccgtccagtcgta 400
P FAM-ccgagccgcaggaaccgcaggag-BHQ1 200
24 PAT F gtcgacatgtctccggagag 400 191 转基因油菜、玉米、棉花、大豆、甜菜等筛选检测
R gcaaccaaccaagggtatc 400
P FAM—tggccgcggtttgtgatatcgttaa-BHQ1 200
25 GOX F gtcttcgtgttgctggaaccgtt 400 121 转基因油菜、玉米、甜菜等筛选检测
R gaactggcaggagcgagagct 400
P FAM-tgctcacgttctctacactcgcgctcg-BHQ1 200
26 CP4-EPSPS F gcaaatcctctggcctttcc 100 146 转基因油菜、大豆、玉米、棉花、马铃薯、甜菜、小麦等筛选检测
R cttgcccgtattgatgacgtc 100
P FAM-tcatgttcggcggtctcgcg-BHQ1 200
27 Cry3A F Tccggttacgaggttctt 400 86 转基因玉米、马铃薯等筛选
检测
R ccatagatttgagcgtcctta 400
P FAM-acctatgctcaagctgccaacaccc-BHQ1 200
28 pNOS F gtgaccttaggcgacttttgaac 340 79 转基因油菜、
马铃薯
R cgcgggtttctggagtttaa 340
P FAM-cgcaataatggtttctgacgtatgtgcttagc-BHQ1 400
表A.1(续)
序号 基因/品系名称 引物/探针序列(5′-3′) 终浓度
nmol/L 产物大小
bp 适用范围
29 pSSuAra F ggcctaaggagaggtgtggaga 340 95 转基因油菜、对拟南芥是内源基因
R ctcatagataacgataagattcatggaatt 340
P FAM-ccttatcggcttgaaccgctggaataa-BHQ1 400
30 pTA29 F gaagctgtgctagagaagatgtttattc 340 117 转基因油菜、对烟草是内源基因
R gctcgaagtatgcacatttagcaa 340
P FAM-agtccagccacccaccttatgcaagtc-BHQ1 400
3l pUbi F gagtagataatgccagcctgtmaac 340 76 转基因棉花、对玉米是内源基因
R acgcgacgctgctggtt 340
P FAM-cgtcgacgagtctaacggacaccaac-BHQ1 400
32 tCaMV 35S F ggggtttcttatatgctcaacacatg 340 118 转基因玉米、
油菜
R tcaccagtctctctctacaaatctatcac 340
P FAM-aaaccctataagaacccumttcccttatctggge-BHQ1 400
33 tE9 F tgagaatgaacaaaaggaccatatca 200 87 转基因玉米、大豆、油菜、棉花、对豌豆是内源基因
R tttttattcggttttcgctatcg 200
P FAM-tcattaactcttctccatccatttccatttcacagt-BHQ1 200
34 tOCS F cggtcaaacctaaaagactgattaca 340 85 转基因油菜
R cgctcggtgtcgtagatact 340
P FAM-tcttatteaaatttcaaaagtgccccaggg-BHQ1 400
35 tg7 F atgcaagtttaaattcagaaatatttcaa 340 97 转基因油菜
R atgtattacacataatatcgcactcagtct 340
P FAM-actgattatatcagctggtacattgccgtagatga-BHQ1 400
36 PMI F Ccgggtgaatcagcgttt 200 59 转基因玉米
R Gccgtggcctttgacagt 200
P FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-BHQ1 200
37 Cry I A(b) F cgcgactggatcaggtaca 400 75 转基因大米、玉米、棉花等外源筛选基因
R tggggaacaggctcacgat 400
P FAM-ccgccgcgagctgaccctgaccgtg-BHQ1 200
38 CRY I A(c) F cggaaatgcgtattcaattcaac 400 71 任选其一，转基因水稻、玉米、棉花
R ttctggactgcgaacaatgg 400
P FAM-acatgaacagcgccttgaccacagc-BHQ1 200
39 CRY I A(c) F gaccctcacagttttggacattg 400 93
R atttctctggtaagttgggacact 400
P FAM-tcccgaactatgactccagaaectaccctatcc-BHQ1 200
表A.1(续)
序号 基因/品系名称 引物/探针序列(5′-3′) 终浓度
nmol/L 产物大小
bp 适用范围
40 pRice-Eactin F tcgaggtcattcatatgcttgag 340 95 转基因玉米、对大米是内源基因
R ttttaactgatgttttcacttttgacc 340
P FAM-agagagtcgggatagtccaaaataaaacaaaggta-BHQ1 400
41 CTP2-CP4-EPSPS F gggatgacgttaattggctctg 375 88 转基因大豆、玉米、棉花、苜蓿
R ggctgcttgcaccgtgaag 375
P FAM-cacgccgtggaaacagaagacatgacc-BHQ1 150
附 录B
(资料性附录)
转基因植物品系特异性实时荧光PCR检测引物探针
转基因植物品系特异性检测用引物探针序列见表B.1。
表B.1 转基因植物品系特异性实时荧光PCR检测引物和探针序列信息表
作物 品系名称 引物/探针序列(5′-3′) 终浓度
nmol/L 产物大小
bp
大豆 GTS40-3-2 F ttcattcaaaataagatcatacatacaggtt 150 84
R ggcatttgtaggagccacctt 150
P FAM-ccttttccatttggg-MGBNFQ 50
MON89788 F tcccgctctagcgcttcaat 150 139
R tcgagcaggacctgcagaa 150
P FAM-ctgaaggcgggaaacgacaatctg-TAMRA 50
A2704-12 F gcaaaaaagcggttagctcct 400 64
R attcaggctgcgcaactgtt 400
P FAM-cggtcctccgatcgcccttcc-TANLRA 200
A5547-127 F gctatttggtggcmtttttcca 400 75
R cactgcggccaacttacttct 400
P FAM-ccgcaatgtcataccgtcatcgttgt-TAMRA 200
DP305423 F cgtgttctctttttggctagc 800 93
R gtgaccaatgaatacataacacaaacta 500
P FAM-tgacacaaatgattttcatacaaaagtcgaga-TAMRA 220
DP356043 F gtcgaataggctaggtttacgaaaaa 750 99
R tttgatattcttggagtagacgagagtgt 750
P FAM-ctctagagatccgtcsacatggtggagcac-TAMRA 200
MON87701 F cgtttcccficcttcagtttaaa 600 89
R tggtgatatgaagatacatgcttagcat 600
P FAM-tcagtgtttgacacacacactaagcgtgcc-TAMRA 250
CV127 F aacagaagtttccgttgagctttaagac 400 88
R cattcgtagctcggatcgtgtac 400
P FAM-tttggggaagctgtcccatgccc-TAMRA 100
MON87705 F ttcccggacatgaagccatttac 450 86
R acaacggtgccttggcccaaag 450
P FAM-aagagactcagggtgttgttatcactgcgg-TAMRA 250
表B.1(续)
作物 品系名称 引物/探针序列(5′-3′) 终浓度
nmol/L 产物大小
bp
大豆 MoN87769 F catactcattgctgatccatgtagatt 600 87
R gcaagttgctcgtgsagttttg 600
P FAM-cccggacatgaagccatttacaattgac-TAMRA 200
FG72 F agatttgatcgggctgcagg 400 70
R gcacgtattgatgaccgcatta 400
P FAM-aatgtggtteatccgtctt-MGBNFQ 200
MON87708 F tcatactcattgctgatccatgtag 300 91
R agaacaaattaacgaaaagacagaacg 300
P FAM-tcccggactttagctcaaaatgcatgta-TAMRA 150
玉米 GA2l F cgttatgctatttgcaactttagaaca 150 112
R gcgatcctcctcgcgtt 1S0
P FAM-tttctcaacagcaggtgggtccgggt-TAMRA 50
NK603 F atgaatgacctcgagtaagcttgttaa 150 108
R aagagataacaggatccactcaaacact 150
P FAM-tggtaccacgcgacacacttccactc-TAMRA 50
Btll F tgtgtggccatttatcatcga 200 68
R cgctcagtggaacgaaaactc 200
P FAM-ttccatgacceaaatcccttaacgtgagt-TAMRA 150
Bt176 F ggccgtgaacgagctgtt 300 82
R gggaagaagcctacatgttttctaa 300
P FAM-agcaaccagatcggccgacacv-TAMRA 200
MON810 F tcgaaggacgaaggactctaacgt 300 92
R gccaccttccttttccactatctt 300
P FAM-aacatcctttgccattgcccagc-TAMRA 180
MON863 F gtaggatcggaaagcttggtac 150 70
R tgttacggcctaaatgctgaact 150
P FAM-tgaacacccatccgaacaagtagggtca-TAMRA 50
T25 F acaagcgtgtcgtgctccac 400 102
R gacatgatactccttccaccg 400
P FAM-tcattgagtcgttccgccattgtcg-TAMRA 200
CBH351 F Tgttactagatcgcagatcctct 400 96
R ctagaaggcaattctaattgatc 400
P FAM-gtcgacctgcaggcatgcaaggaattccatt-TAMRA 200
表B.1(续)
作物 品系名称 引物/探针序列(5′-3′) 终浓度
nmol/L 产物大小
bp
玉米 TC1507 F tagtcttcggccagaatgg 300 58
R ctttgccaagatcaagcg 300
P FAM-taactcaaggccctcactccg-TAMRA 150
59122 F 989ataagcaagtaaaagcgctc 250 86
R ccttaattctccgctcatgatcag 250
P FAM-tttaaactgaaggcgggaaacgacaa-TAMRA 200
MIR604 F gcgcacgcaattcaacag 600 76
R ggtcataacgtgactcccttaattct 300
P FAM-aggcgggaaacgacaatctgatcatg-TAMRA 200
3272 F tcatcegsccagattctcttttstgtgg 50 95
R cgtttcccgccttcagttta 900
P FAM-actgctgacgcggccaaacactg-TAMRA 200
LY038 F tgggttcagtctgcgaatgtt 150 111
R aggaattcgatatcaagcttatcga 160
P FAM-cgagcggagtttatgggtcgacgg-TAMRA 50
MON89034 F ttctccatattgsccttcatactcatt 450 77
R csgtatctataataccgtggtttttaaa 450
P FAM-atccccggaaattatl4tt-MGBNFQ 100
MON88017 F gagcaggacctgcagaagct 150 95
R tccggagttgaccatcca 150
P FAM-tcccgccttcagtttaaacagagtcgggt-TAMRA 50
98140 F gtgtgtatgtctctttgcttggtctt 500 80
R gattgtcgtttcccgccttc 500
P FAM-ctctatcgatccccctctttgatagtttaaact-TAMRA 200
MIR162 F gcgcggtgtcatctatgttactag 300 92
R tgccttatctgttgccttcaga 300
P FAM-tctagacaattcagtacattaaaaacgtccgcca-TAMRA 150
DAS40278 F cacgaaccattgagttacaatc 350 98
R tggttcattgtattctggctttg 350
P FAM-egtagctaaccttcattgtattccg-TAMRA 150
MON87460 F cacgttgaaggaaaatggattg 600 82
R tcgcgatcctcctcaaagac 600
P FAM-agggagtatgtagataaattttcaaagcgttagacggc-TAMRA 250
表B.1(续)
作物 品系名称 引物/探针序列(5′-3′) 终浓度
nmol/L 产物大小
bp
棉花 MON531 F tcccattcgagtttctcacgt 150 72
R aaccaatgccaccccactga 150
P FAM-ttgtccctccacttcttctc-TAMRA 50
MON1445 F ggagtaagacgattcagatcaaacac 150 87
R atcgacctgcagcccaagct 150
P FAM-atcagattgtcgtttcccgccttcagttt-TAMRA 50
MON15985 F gttactagatcgggatatcc 150 82
R aaggttgctaaatggatggga 150
P FAM-ccgctctagaactagtggatctgcactgaa-TAMRA 50
MON88913 F ggctttggctaccuaagagagtc 500 94
R caaattacccattaagtagccasattac 500
P FAM-aactatcagtgtttgactacat-MGBNFQ 100
LLCotton25 F cagatttttgtgggattggaattc 400 79
R caaggaactattcaactgag 400
P FAM-cttaacagtactcggccgtcgaccgc-TAMRA 200
GHB614 F caaatacacttggaacgacttcgt 400 119
R gcaggcatgcaagcttttaaa 400
P FAM-ctccatggcgatcgctacgttctagaatt-TAMRA 200
281-24-236 F ctcattgctgatccatgtagatttc 350 111
R ggacaatgctgggctttgtg 450
P FAM-ttgggttaataaagtcagattagagggagacaa-TAMRA 175
3006-210-23 F aaatattaacaatgcattgagtatgatg 400
R actctttctttttctccatattgacc 400 90
P FAM-tactcattgctgatccatgtagatttcccg-TAMRA 150
T304-40 F agcgcgcaaactaggataaatt 400 78
R cctagatcttgggataacttgaaaaga 400
P FAM-tcgcgcgcggtgtcatctatctc-TAMRA 200
GBH119 F ccagtactaaaatccagatcatgca 400 90
R gaaattgcgtgactcaaattcc 400
P FAM-cctgcaggtcgacggccgagtac-TAMRA 200
水稻 TT51-1(Bt63) F agagactggtgatttcagcggg 400 119
R gcgtccagaaggaaaaggaata 400
P FAM-atctgccccagcactcgtccg-TAMRA 200
表B.1(续)
作物 品系名称 引物/探针序列(5′-3′) 终浓度
nmol/L 产物大小
bp
水稻 LLRice62 F agctggcgtaatagcgaagagg 400 88
R tgctaacgggtgcatcgtcta 400
P FAM-cgcaccgattatttatacttttagtccacct-TAMRA 200
LLRice601 F tctaggatccgaagcagatcgt 400 68
R ggagggcgcggagtgt 400
P FAM-ccacctcccaacaataaaagcgcctg-TAMRA 200
114-7-2 F ccgacgcggaggaagac 400 69
R cgtttcccgccttcagttta 400
P FAM-cggaggcggcgtcaaacactg-TAMRA 200
Kefeng 6 F gcttggatcagattgtcgttt 400 154
R gtcagataaactgattggtctgat 400
P FAM-cgacaaaagatcaggatttggg-ECLIPSE 200
Kefeng 8 F atattctgaagtggcctgtt 400 171
R cgaccatgatgctgttctgc 400
P FAM-cgttatttatgagatgggtgatctcacccatgcttg-TAMRA 200
KMD1 F tccgcaatgtgttattaagttgtctaa 300 78
R ccgatatgcctgcccatct 900
P FAM-cgtcaatttgtttacaccacaatatatcccg-TAMRA 100
油菜 GT73(RT73) F ccatattgaccatcatactcattgct 150 108
R gcttatacgaaggcaagaaaagga 150
P FAM-ttcccggacatgaagatcatcctcctt-TAMRA 50
MS8 F gttagaaaaagtaaacaattaatatagccgg 400 130
R ggagggtgtttttggttatc 400
P FAM-aatataatcgacggatccccgggaattc-TAMRA 200
MS1 F acgctgcggacatctacatt 400 187
R ctagatcggaagctgaagatgg 400
P FAM-ctcattgctgatccacctagccgactt-TAMRA 200
RF1 F ctaagggaggtcaagatgtagc 400 113
R cgggcctaacttttggtgtg 400
P FAM-ctcatcatcctcacccagtcagcatca-TAMRA 200
RF2 F gggtgagacaatatatcgacg 200 104
R gggcatcgcaccggtgag 200
P FAM-caccggccaaattcgctcttasccgt-TAMRA 200
表B.1(续)
作物 品系名称 引物/探针序列(5′-3′) 终浓度
nmol/L 产物大小
bp
油菜 RF3 F cataaaggaagatgafagacttgag 400 139
R agcatttagcatgtaccatcagaca 400
P FAM-cgcacgcttatcgaccataagccca-TAMRA 200
Oxy-235 F ctaacttttggtgtgatgatgctga 400 124
R cgatagatggtggtgtgagtcttg 400
P FAM-agctgatggcaagttaatctccccgaagtcg-DABCYL 200
T45 F caatggacacatgaattatgc 400 123
R gactctgtatgaactgttcgc 400
P FAM-tagaggacctaacagaactcgccgt-TAMRA 200
Topas19/2 F gcggttctgtcagtt 400 95
R cgaccggcgctgatatatga 400
P FAM-tcccgcgtcatcggcgg-TAMRA 200
73496 F gttcttctcttcatagctcattacagtttt 600 84
R caaacctccatagagttcaacatcttaa 600
P FAM-ttagttagatcaggatattcttg-MGBNFQ 250
MON88302 F tcccttgaaccttattttatagtgcaca 450 10l
R tcagattgtcgtttcccgccttca 450
P FAM-tagtcatcatgttgtaccacttcaaacact-BHQ1 200
马铃薯 EH92-527-1 F gtgtcaaaacacaatttacagca 300 134
R tcccttaatttctccgctcatga 300
P FAM-agattgtcgtttcccgccttcagtt-TAMRA 160
亚麻 Fp967 F agcgcgcaaactaggataaa 800 105
R accttccggctcgatgtcta 800
P FAM-cgcgcgcggtgtcatctatg-BHQ1 100
甜菜 H7-1 F tgggatctgggtggctctaact 400 108
R aatgctgctaaatcctgag 400
P FAM-aaggcgggaaacgacaatct-TAMRA 100
木瓜 Huanong No.1 F gacgagtacaaggagacgcc 400 174
R gttgtcactgaagcgggaag 400
P FAM-tggctgctattgggcgaatcaactac-BHQ1 200
