标准编号:	GB/T 16886.3-2019
中文名称:	医疗器械生物学评价 第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验
英文名称:	Biological evaluation of medical devices—Part 3:Tests for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity
中标分类:	C30    医疗器械综合
行业分类:	GB    国家标准
ICS分类:	11.100 11.100    实验室医学 11.100
发布机构:	国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会
发布日期:	2019-06-04
实施日期:	2020-1-1
标准状态:	现行
替代旧标准:	GB/T 16886.3-2008 医疗器械生物学评价 第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验
翻译语言:	英文
文件格式:	PDF
中文字符数:	33000 字
翻译价格(元):	650.00 元
交付时间:	付款后 1 个工作日

Biological evaluation of medical devices -

Part 3: Tests for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity



1 Scope



This part of GB/T 16886 specifies strategies for risk estimation, selection of hazard (sources) identification tests and risk management, with respect to the possibility of the following potentially irreversible biological effects arising as a result of exposure to medical devices:



- genotoxicity;



- carcinogenicity;



- reproductive and developmental toxicity.



This part is applicable when the need to evaluate a medical device for potential genotoxicity, carcinogenicity, or reproductive toxicity has been established.



Note: Guidance on selection of tests is provided in ISO 10993-1.



2 Normative references



The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.



ISO 10993-1 Biological evaluation of medical devices - Part 1 : Evaluation and testing within a risk management process

ISO 10993-2 Biological evaluation of medical devices - Part 2 : Animal welfare requirements

ISO 10993-6 Biological evaluation of medical devices - Part 6 : Tests for local effects after implantation

ISO 10993-12 Biological evaluation of medical devices - Part 12 : Sample preparation and reference materials

ISO 10993-18 Biological evaluation of medical devices - Part 18 : Chemical characterization of materials

OECD 414 Prenatal Development Toxicity Study)

OECD 415 One-Generation Reproduction Toxicity Study

OECD 416 Two-Generation Reproduction Toxicity

OECD 421 Reproduction/Developmental Toxicity Screening Test

OECD 451 Carcinogenicity Studies

OECD 453 Combined Chronic Toxicity/Carcinogenicity Studies

OECD 471 Bacterial Reverse Mutation Test

OECD 473 In vitro Mammalian Chromosome Aberration Test

OECD 476 In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests using the Hprt and Xprt genes

OECD 487 In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test



3 Terms and definitions



For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 10993-1, ISO 10993-12 and the following apply.



3.1

carcinogenicity test

test to determine the carcinogenic potential of medical devices, materials, and/or extracts using multiple exposures for a major portion of the life span of the test animal



3.2

energy-depositing medical device

device intended to exert its therapeutic or diagnostic effect by the delivery of electromagnetic radiation, ionising radiation or ultrasound



Note: This does not include medical devices that deliver simple electrical current, such as electrocautery medical devices, pacemakers or functional electrical stimulators.



3.3

genotoxicity test

test using mammalian or non-mammalian cells, bacteria, yeasts, fungi or whole animals to determine whether gene mutations, changes in chromosome structure, or other DNA or gene changes are caused by the test samples



3.4

maximum tolerated dose; MTD

maximum dose that a test animal can tolerate without any adverse effects



3.5

reproductive and developmental toxicity test

test to evaluate the potential effects of test samples on reproductive function, embryonic morphology (teratogenicity), and prenatal and early postnatal development



3.6

test sample preparation

residual, extractables, leachables or biodegradable device materials that are resuspended in a vehicle compatible with the test system



4 Requirements for test strategies



4.1 General



ISO 10993-1 indicates circumstances where the potential for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity is a relevant hazard for consideration in an overall biological safety evaluation. Testing to investigate these hazards shall be justified on the basis of a risk assessment. In determining if genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity testing of the device is warranted an assessment of risk shall address the following factors



- an analysis of the chemical constituents of the device material(s), including manufacturing process residues and degradation products or metabolites, to identify causes of concern on the basis of structure-activity relationships or previous demonstration of relevant toxicity in the chemical class,



- the mechanistic basis of the toxic response under consideration, if available,



- existing information relevant to the genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity evaluation of the medical device,



- the extent of previous use of comparable materials in relevant applications,



- consideration of residuals from the final finished device with respect to how well they are characterized and their potential biological activity (e.g. structure-activity relationships, or previous demonstration of relevant outcomes),



- exposure route,



- patient population,



- extent and duration of localized (at the site of implantation or use) and systemic exposure,



- the anticipated impact of test results (or lack of testing) on risk management judgements, and



- changes in the type or amount of residuals that the patient will be exposed to, either through an increase in device exposure, or an increase in devices size when compared to an equivalent device.



Commonly used risk assessment tools [e.g. TTC[) TTC is short for Threshold toxicological concern.])] may be helpful in evaluating these factors.



Where an analysis of the composition of device materials reveals the presence of chemical constituents that are of concern but for which inadequate toxicity data are available, consideration shall be given to testing individual chemical. Individual chemicals shall be tested in preference to compounded materials or extracts, where this would improve the risk estimate. Where testing of a device material is indicated testing shall be conducted on the final product (including sterilization if applicable), or representatives from the final products, or materials processed in the same manner as the final product (including sterilization if applicable). The decision to test, and the nature of the test sample, shall be justified and documented.



Testing may be warranted for additional states of the device such as, wear debris generated from the device or materials that cure in situ (e.g. cements, adhesives and pre-polymer mixtures) unless toxicological risk assessment determines no cause for concern from additional device/material states. For guidance on in situ curing devices see ISO 10993-12.



4.2 Additional requirements for carcinogenicity testing



For carcinogenicity testing, in addition to 4.1, the following factors shall be addressed:



- physical characteristics (e.g. particle size and shape, pore size, surface continuity, surface condition, device thickness);



- results from genotoxicity, implantation and other studies.



4.3 Additional requirements for reproductive toxicity testing



For reproductive testing, in addition to 4.1, the total direct or indirect cumulative contact duration with reproductive tissue, the embryo/foetus or the germ cells shall be addressed.



Any information from published literature on the effect of device materials on male/female reproductive organs or from subacute/chronic study on the histopathology of reproductive system should also form the basis before a full scale reproductive toxicity testing is performed.

ICS 11.100.20
CCS C 30

中华人民共和国国家标准
GB/T 16886.23—2023/ISO 10993-23：2021
医疗器械生物学评价
第23部分：刺激试验
Biological evaluation of medical devices—Part 23：Tests for irritation
(ISO 10993-23：2021，IDT)
2023-11-27发布 2024-12-01实施
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
发布


前言
本文件按照GB/T 1.12020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件是GB/T(Z)16886《医疗器械生物学评价》的第23部分。GB/T(Z)16886已经发布了以下部分：
——第1部分：风险管理过程中的评价与试验；
——第2部分：动物福利要求；
——第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验；
——第4部分：与血液相互作用试验选择：
——第5部分：体外细胞毒性试验；
——第6部分：植入后局部反应试验；
——第7部分：环氧乙烷灭菌残留量；
——第9部分：潜在降解产物的定性和定量框架；
——第10部分：刺激与皮肤致敏试验；
——第11部分：全身毒性试验；
——第12部分：样品制备与参照材料；
——第13部分：聚合物医疗器械降解产物的定性与定量；
——第14部分：陶瓷降解产物的定性与定量；
——第15部分：金属与合金降解产物的定性与定量；
——第16部分：降解产物与可沥滤物毒代动力学研究设计；
——第17部分：可沥滤物允许限量的建立；
——第18部分；风险管理过程中医疗器械材料的化学表征；
——第19部分：材料物理化学，形态学和表面特性表征；
——第20部分：医疗器械免疫毒理学试验原则和方法；
——第22部分：纳米材料指南；
——第23 部分：刺激试验。
本文件等同采用ISO 10993-23：2021《医疗器械生物学评价 第23部分；刺激试验》。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由国家药品监督管理局提出。
本文件由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会(SAC/TC 248)归口。


引言
本文件用于评估医疗器械可能引起的刺激性接触危险。
医疗器械中所含有的某些材料已进行过试验，其潜在的皮肤、黏膜刺激性已被确认。其他一些未做过试验的材料及其化学成分在与人体组织接触时可能会产生不良作用。因此，制造商有责任在投放市场前评价器械的潜在不良作用。
医疗器械或其组件的潜在刺激性能通过体内动物刺激试验或通过经确认可用于医疗器械的体外刺激试验进行预测。
GB/T 16886.2描述了为医疗器械生物学评价进行动物研究的动物福利方面的内容，因此本文件中也强调了动物研究的替代，减少和优化的3R原则，本文件描述了通过体外试验或体内试验来检测医疗器械、材料或其浸提液的刺激性的试验。在经适当验证同样能提供体内试验获取的相关信息时，体外试验优先于体内试验(见GB/T 16886.1和 GB/T 16886.2)。
传统上，人体试验之前要先进行小动物试验以助于预测人体反应。最近，还增加了作为辅助或替代的体外试验以及人体试验。利用重建人表皮(RhE)模型开发了用于纯化学物皮肤刺激试验的体外试验。该方法被应用于检测医疗器械浸提液中的刺激性化学物质。一项测试两种类型RhE模型的大型比对试验结果表明，这些模型也可用于检测常用于制造医疗器械的高分子材料[聚氯乙烯(PVC)和硅树脂]中浸提出的刺激性化学物质。在检测一些低浓度强刺激性化合物时，本方法与人斑贴试验和兔皮内反应试验相比同样敏感。因此，刺激物检测的逐步评价程序可以从RhE模型体外试验开始。
成熟的和经验证的RhE模型适用于预测皮肤组织的刺激反应。推荐探索使用其他体外替代模型来评估应用于黏膜或眼上皮器械的潜在刺激性。
进行这些研究用于注册申报时遵循GLP或适用于相关国家的ISO /IEC 17025，并遵守与动物福利有关的规则。建议在适宜的情况下对数据进行统计分析。
本文件由经过培训的且有经验、有适当资格的专业人员使用，能够解释标准要求并能考虑与器械全部相关因素，包括器械的预期用途、由科学文献的评审和先前临床经验给出的该医疗器械的当前知识，来判定每一医疗器械的评价结果，
本文件所包括的试验是安全产品开发的重要工具。前提是它们由经过培训的人员进行试验并解释试验结果。
本文件以诸多标准和导则为基础，包括经济合作与发展组织(OECD )试验导则(TG)、美国药典和欧洲药典。本文件旨在作为基础文件，用于选择和实施能评价与医用材料和器械安全性相关的刺激反应的试验。
附录A中给出了具体涉及以上试验材料制备的说明。附录D中描述了几种特殊的体内刺激试验，用于非皮肤区域应用的医疗器械。此外，附录E提供了进行人体皮肤刺激试验的信息。
GB/T(Z) 16886《医疗器械生物学评价》拟由二十一个部分构成：
——第1部分：风险管理过程中的评价与试验。目的是保护人类免于因使用医疗器械所产生的潜在生物学风险，并在风险管理过程中描述医疗器械生物学评价，将其作为医疗器械总体评价和开发过程的一个组成部分。
——第2部分：动物福利要求。目的是最大限度利用科学合理的非动物试验，确保用于评价医疗器械所用材料的生物学性能动物试验符合认可的伦理和科学原则。
——第3部分：遗传毒性，致癌性和生殖毒性试验。目的是为已确定具有潜在的遗传毒性，致癌性或生殖毒性的医疗器械提供评价指南和方法。
——第4部分：与血液相互作用试验选择。目的是为医疗器械与血液相互作用评价提供通用要求。
——第5部分：体外细胞毒性试验。目的是为评估医疗器械体外细胞毒性提供试验方法。
——第6部分：植入后局部反应试验。目的是为评估医疗器械所用生物材料植入后局部反应提供试验方法。
——第7部分：环氧乙烷灭菌残留量。目的是为经环氧乙烷(EO)灭菌的单件医疗器械上EO及2-氯乙醇(ECH)残留物的允许限量，EO及ECH残留量提供检测步骤以及确定器械是否可以出厂提供检测方法。
——第9部分：潜在降解产物的定性和定量框架。目的是为系统评价医疗器械潜在的和已观察到的生物降解以及生物降解研究的设计与实施提供基本原则。
——第10部分：刺激与皮肤致敏试验。目的是为医疗器械及其组成材料潜在刺激和皮肤致敏提供评价步骤。
——第11部分；全身毒性试验。目的是为评价医疗器械材料导致潜在不良全身反应时提供试验步骤指南。
——第12部分：样品制备与参照材料。目的是为医疗器械生物学评价中样品制备方法和参照材料提供选择指南。
——第13部分：聚合物医疗器械降解产物的定性与定量。目的是为用于临床的成品聚合物医疗器械模拟环境的降解产物定性与定量试验设计提供通用要求。
——第14部分：陶瓷降解产物的定性与定量。目的是为从陶瓷材料获取降解产物定量用的溶液提供方法。
——第15部分：金属与合金降解产物的定性与定量。目的是为金属医疗器械或可供临床使用的相应材料样品的降解产物提供定性与定量试验设计的通用要求。
——第16部分：降解产物与可沥滤物毒代动力学研究设计。目的是提供与医疗器械相关的设计和实施毒代动力学研究的原则。
——第17部分：可沥滤物允许限量的建立。目的是为医疗器械可沥滤物允许限量的建立提供方法。
——第18部分：风险管理过程中医疗器械材料的化学表征。目的是为医疗器械成分的定性和定量(必要时)以识别生物危险以及估计和控制材料成分中的生物学风险提供框架。
——第19部分：材料物理化学、形态学和表面特性表征。目的是识别与评价最终医疗器械材料的物理特性，如物理化学，形态学和表面特性(PMT)的各种参数和试验方法。
——第20部分：医疗器械免疫毒理学试验原则和方法。目的是为医疗器械潜在免疫毒性方面提供免疫毒理学综述以及为检验不同类型医疗器械的免疫毒性提供方法指南。
——第22部分；纳米材料指南，日的是为包含，产生或由纳米材料组成的医疗器械生物学评价提供指南。
——第23部分：刺激试验。目的是为医疗器械及其组成材料潜在刺激提供评价步骤。


医疗器械生物学评价
第23部分：刺激试验
1 范围
本文件规定了医疗器械及其组成材料潜在刺激的评估步骤：包括以下内容：
——刺激试验前的考虑，包括皮肤接触方面的计算机模拟试验和体外方法；
——详细的体外和体内刺激试验步骤；
——结果解释的关键因素。
本文件适用于根据ISO 10993-1和ISO 10993-2对医疗器械、材料或其浸提液的潜在刺激性进行预测和分类。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 16886，1—2022医疗器械生物学评价 第1部分：风险管理过程中的评价和试验(ISO )10993-1：2018，IDT)
ISO 10993-1医疗器械生物学评价 第1部分：风险管理过程中的评价与试验(Biological evaluation of medical devices—Part 1：Evaluation and testing within a risk management process)
ISO 10993-2医疗器械生物学评价 第2部分：动物福利要求(Biological evaluation of medical devices—Part 2：Animal welfare requirements)
注：GB/T 16886.2—2011医疗器械生物学评价 第2部分：动物福利要求(ISO 10993-2：2006，IDT)
ISO 10993-9医疗器械生物学评价 第9部分；潜在降解产物的定性和定量框架(Biological evaluation of medical devices—Part 9：Framework for identification and quantification of potential degradation products)
注：GB/T 16886.9—2022医疗器械生物学评价 第9部分：潜在降解产物的定性和定量框架(ISO 10993-9：2019，IDT)
ISO 10993-12医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与参照材料(Biological evaluation of medical devices—Part 12：Sample preparation and reference materials)
注：GB/T 16886.12—2023医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与参照材料(ISO 10993-12：2021，IDT)
ISO 10993-13医疗器械生物学评价 第13部分：聚合物医疗器械的降解产物的定性与定量(Biological evaluation of medical devices—Part 13：Identification and quantification of degradation products from polymeric medical devices)
注：GB/T 16886.13—2017医疗器械生物学评价 第13部分：聚合物降解产物的定性与定量(ISO 10993-13：2010，IDT)
ISO 10993-14医疗器械生物学评价 第14部分：陶瓷降解产物的定性与定量(Biological evaluation of medical devices—Part 14：Identification and quantification of degradation products from ceramics)
注：GB/T 16886.14—2003医疗器械生物学评价 第14部分：陶瓷降解产物的定性与定量(ISO 10993-14：2001，IDT)
ISO 10993-15医疗器械生物学评价 第15部分：金属与合金降解产物的定性与定量(Biological evaluation of medical devices—Part 15：Identification and quantification of degradation products from metals and alloys)
注：GB/T 16886.15—2022医疗器械生物学评价 第15部分：金属与合金降解产物的定性与定量(ISO 10993-15：2019，IDT)
ISO 10993-18医疗器械生物学评价 第18部分：风险管理过程中医疗器械材料的化学表征(Biological evaluation of medical devices—Part 18：Chemical characterization of medical device materials within a risk management process)
注：GB/T 16886.18—2022医疗器械生物学评价 第18部分：风险管理过程中医疗器械材料的化学表征(ISO 10993-18；2020，IDT)
ISO 14155用于人体的医疗器械临床研究 良好临床规范(Clinical investigation of medical devices for human subjects—Good clinical practice)
OECD 404急性皮肤刺激/腐蚀(Acute Dermal Irritation/Corrosion)
OECD 439体外皮肤刺激：重建人表皮试验法(In Vitro Skin Irritation：Reconstructed Human Epidermis Test Method)
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
ISO 和IEC维护的用于标准化的术语数据库，地址如下：
——IEC电子百科：http：//www.electropedia，org/；
——ISO在线浏览平台：http：//www.iso.org/obp。
3.1
空白 blank
与样品测定溶液相同方式制备但不含待测分析物的溶液。
[来源：ISO 10136-1：1993，3.8，有修改]
3.2
用量 dose
剂量 dosage
每单位体重或表面积试验样品(3.14)的给予量(如质量、体积)。
注：这两个术语通常会交换使用(“剂量”较为常用)。
3.3
红斑erythema
皮肤或黏膜发红。
3.4
焦痂eschar
皮肤结痂或变色的蜕皮。
3.5
浸提液extract
在受控条件下将某一试验或对照材料与浸提介质(3.16)接触后得到的液体或悬浮液。
3.6
刺激物 irritant
引起刺激(3.7)的物质。
3.7
刺激 irritation
一次、多次或持续与一种物质/材料接触所引起的局部非特异性炎症反应。
注：皮肤刺激是一种可逆反应，主要以皮肤局部红斑(3.3)(发红)和肿胀[水肿(3.10)]为特征。
3.8
坏死 necrosis
由于损伤或疾病造成的不可逆改变直接导致的细胞死亡。
注：组织修复会导致完全性功能恢复或瘢痕形成。
3.9
阴性对照 negative control
经充分表征的材料或物质，当用特定试验方法评估时，显示该试验系统适宜产生可重复的，适当阴性的、无反应的或最小的应答。
注：实际操作中，阴性对照(NC)包括空白(3.1)、介质(3.16)/溶剂和参照材料。
3.10
水肿oedema
液体向组织内异常渗透引起的肿胀。
3.11
阳性对照 positive control
经充分表征的材料或物质，当用特定试验方法评估时，显示该试验系统适宜产生可重复的、适当阳性的或反应性的应答。
3.12
皮肤腐蚀skin corrosion
应用某一试验样品(3.14)后皮肤的不可逆性损伤结果，表现为从表皮至真皮的明显坏死(3.8)。
示例：混合物/化学物/试验样品作用所导致的皮肤溃疡(见3.15)。
3.13
试验材料test material
取样供生物学或化学试验用的材料、器械、器械的一部分或其组件。
3.14
试验样品test sample
用于生物学或化学试验或评价的医疗器械、组件、材料、法提液(3.5)或其中部分。
3.15
溃疡 ulceration
表现为浅表组织缺损的开放性溃烂。
3.16
介质 vehicle
用于湿化、稀释、悬浮、浸提或溶解试验物质/材料的液体。
3.17
介质对照vehicle control
不加试验材料(3.13)的浸提介质(3.16)，置于与试验材料相同的容器中，并经受与试验材料相同的浸提条件。
注：介质对照(VC)的日的是评价没提容器、浸提介质和浸提过程可能的干扰作用。
4基本原则——逐步评价法
现有检测刺激的试验方法特别设定为测定潜在的皮肤刺激和黏膜刺激作用，这些试验一般不预测其他类型的不良作用(如致敏)。历史上刺激试验是在兔身上进行的。对于植入医疗器械或外部接入医疗器械，皮内注射试验更为接近实际应用，因此用于检测刺激作用，皮内试验如7.2所示。
当新的体外试验作为体内试验的替代，已经过科学验证符合医疗器械的使用要求，并且可以合理且切实可行地使用的时候，根据ISO 10993-2，应考虑优选体外试验。一项测试了两种RhE模型的大型比对试验结果表明，这些模型也能用于检测常用于制造医疗器械的高分子材料[聚氯乙烯(PVC)和硅树脂]中浸提出的化学刺激物。在检测一些低浓度强刺激性化合物时，本方法与人斑贴试验和兔皮内反应试验相比同样敏感。因此，应考虑在动物试验或人斑贴试验之前进行这种体外刺激试验。
注1；提供RhE模型对在测试特定医疗器械适用性的详细信息可能是相关的。
本文件描述了一种逐步评价法，其中应包括下列一项或多项内容：
a)化学表征，需要时按照ISO 10993-9、ISO 10993-13、ISO 10993-14、ISO 10993-15和ISO 10993-18规定的基本原则补充样品的化学试验；
b)文献审查，如ISO 10993-1所述，包括化学和物理特性的评价，以及任何产品组分以及结构相关化学品和材料的潜在刺激性信息；
注2：计算机模拟方法如构效关系、定量的构效关系(QSAR)、交叉参照可能指示潜在刺激活性。
c)采用6.2～6.12中经验证的RhE方法进行体外替代试验；
注3：对于与预期用于特殊部位(见附录D)，即黏膜或眼上皮的医疗器械相关的特殊刺激试验，RhE模型不适用。若经证实可用于医疗器械，推荐探索使用其他相关细胞或组织的体外模型。
d)体内动物试验：
注4：当不能表征试验材料或不能采用在a)、b)和c)中规定的方法获取的信息进行风险评估时，体内动物试验是适用的。
e)根据ISO 14155和人体临床研究的伦理原则，不应在通过a)～d)中所述的一项或多项评价确定器械的潜在刺激性之前进行临床试验。
5试验前的考虑
5.1总体要求
需要强调的是试验前的考虑是非常重要的，其能够得出无需进行刺激试验的结论。例如，若试验样品pH≤2.0或≥11.5，此材料应被认为是刺激物，根据OECD 404不应进行进一步的刺激试验。
GB/T 16886.1—2022第5章规定的医疗器械分类要求和下列要求是适用的。
非无菌样品应仅通过局部试验进行体内研究，因为试验样品微生物污染的可能性会干扰最终试验解释。对不能保证无菌但仍认为是无污染的试验样品，则应论证皮内应用是合理的。
5.2材料类型
5.2.1基本考虑
应考虑在医疗器械制造和装配期间可能用作加工助剂的其他化学成分，例如，润滑剂或脱模剂。除了原材料和制造加工助剂的化学成分外，装配黏合剂/溶剂残留物以及灭菌残留物或灭菌过程所致的反应性产物可能存在于终产品中。这些成分是否产生健康危险/风险取决于终产品的可沥滤或降解性能，应考虑这些成分潜在的刺激活性。以下类型材料经常用于医疗器械并可引入刺激风险。
5.2.2陶瓷、金属和合金
就化学成分的数量而言，这些材料通常不如聚合物和生物衍生材料复杂。
5.2.3聚合物
这类材料化学成分通常比陶瓷、金属和合金更复杂，可能有若干反应性产物/杂质/添加剂，而且聚合反应的完全程度可能会有不同。
5.2.4生物衍生材料
这类材料在其成分方面本身就很复杂，也常含有加工残留物，如交联剂和抗生素。生物材料的不同样品之间的成分可能是不一致的。
5.3化学组成方面的信息
5.3.1 总体要求
应根据ISO 10993-18对医疗器械化学成分进行描述。如ISO 10993-1所述，所需的物理和/或化学表征程度取决于对材料配方的了解程度以及人体与医疗器械接触的性质和时间。至少，表征应涉及医疗器械的组成化学物质以及制造过程中可能残留的过程助剂或添加剂。化学成分表征所需的严格程度主要取决于接触的性质、程度、频率和持续时间以及识别的医疗器械或材料的危险。在与生物安全有关的情况下，还应获得定量数据。如果无法获得定量数据，应论证并记录其合理性。
5.3.2现有的数据来源
可能的情况下应从原材料供应商处索取化学组成方面的定性与定量信息。聚合物常要求专利信息的使用权，宜签署转让和使用这种机密信息的条款。
还应从产品制造的制造链的适宜成员中(包括半成品和零件制造商)索取其他任何生产过程中的添加剂(如脱模剂)的定性信息。
在没有任何化学组成数据的情况下，建议研究文献以确定原材料和任何添加剂的可能特性，这样有助于选择相关材料最适宜的分析方法。
应按照ISO 10993-18进行医疗器械的化学表征。
注：依据ISO或美国试验材料协会(ASTM)标准和/或用户的要求能规定陶瓷、金属和合金的成分，但为了获取完整的成分定性与定量资料，可能还需要要求原材料供应商或制造厂以及零件制造厂提供这些信息，以保证还能鉴别加工助剂。监管机构持有的材料主文档是另一个可访问的数据来源。
6体外刺激试验
6.1总则
用于测试刺激性的体外RhE模型是专为检测纯化学物皮肤刺激性而研发的(见OECD 439)。此方法被调整后采用两种RhE模型进行验证，用于检测医疗器械浸提液中刺激性化学物质。在检测一些高分子医用材料(PVC和硅树脂)浸提液中的低浓度强刺激性化合物时，本方法与人斑贴试验和兔皮内反应试验相比同样敏感。因此，本文件描述的RhE试验能替代通过皮肤和皮内(皮肤内)接触的体内兔刺激试验。
注：提供有关正在测试的特定医疗器械的RhE模型适用性的详细信息可能是相关的。
6.2体外重建人表皮模型
6.2.1试验系统——重建人类表皮模型
RhE模型应含有正常人源表皮角质形成细胞，这种细胞经培养可形成多层高度分化的人表皮模型。它应包括具有组织构造的基底层、棘层、颗粒层及与体内类似的包含细胞间层状脂质层的多层角质层。从健康志愿者获取的正常人角质形成细胞应在薄膜或滤纸上的气液交界面培养数日，以形成包括主基底层、基底上层、棘层和颗粒层以及有功能的角质层在内的三维表皮模型。此模型系统应允许极性(如生理盐水)和非极性(如芝麻油)浸提液直接加至RhE模型的上表面。
不适合浸提的材料(如液体、凝胶、糊剂和颗粒)可能适用于此试验系统。如果使用，宜在测试前提供验证数据，以证明该方法检测这些材料形式的刺激活性的能力。
6.2.2试验原则
终点：细胞活性的测定基于3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的细胞还原反应及后续紫色甲臜盐的转化，之后再将甲臜从组织中萃取出来后进行定量测定。处理组织的细胞活性以阴性介质对照的百分比表示，以活性百分比的减少预测刺激的可能性。
注1：组织存活的减少可能伴随IL-1α的释放。能收集接触组织培养基≤-20℃冰冻保存用于可能的细胞因子分析。
简要步骤：对专门制作的含有低浓度刺激化学物的聚合物生物材料进行的研究表明，与OECD 439纯化学物方案相比需延长接触时间。在37℃接触生物材料浸提液中潜在的低浓度刺激物培养不少于18h～24h的时间，足以通过组织活性降低50%以上预测体外刺激性。在采用医疗器械没提液进行的评估RhE模型的比对试验中，18h和24h接触得到了相似的结果。
加入试验和对照浸提液后的组织在37℃，5% CO2的湿化培养箱培养。
通过杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)或不含Ca2+、Mg2+的PBS冲洗以终止试验样品浸提液的接触。冲洗后将RhE组织表面吸干。将组织与MTT溶液在24孔板中(1 mg/mL，300μL/孔)培养3h后评估活性。室温条件下采用适量(取决于采用的RhE模型)异丙醇萃取甲臜结晶至少2h。从每块RhE组织萃取的甲臜中取2份或3份(根据说明书)加入96孔板(200μL/孔)后测定570nm处的吸光度。
对直接接触试验，分别用体积分数1%的溶于0.9%氯化钠注射液的十二烷基硫酸钠(SDS，见6.4.4)溶液作阳性对照(PCs)，DPBS或不含Ca2+、Mg2+的PBS处理的表皮作阴性对照。对于浸提液试验，添加经验证为刺激物质的对照在芝麻油和0.9%氯化钠注射液浸提后能用作阳性对照。
注2：收集18h或24h接触后的组织培养基能冰冻保存(至少-20℃)以备作为细胞活性补充测定终点的细胞因子(IL-1α)测定。除细胞活性MTT试验间接确定的细胞损伤成分：IL-1α测定确定皮肤刺激评估中的炎症成分。
介质对照应包括已进行了ISO 10993-12医疗器械浸提程序的生理盐水(NaC1，0.9%)溶液和芝麻油，每一处理组织的活性以阴性DPBS或PBS处理的对照组织的百分比表示(均值)。
本方法的已知局限性：不适用于气体或气溶胶，也不适用于评价固体材料直接接触的刺激性，因为不能保证整个试验表面紧密接触。
已知需要特殊对照的试验化合物的情况：某些化学物能直接还原MTT试剂(如亲电子试剂、高pH试验样品)，还有化学物能直接将组织或细胞染色。只有在接触过程结束时组织上仍有足量的化学物质时，这些试验样品特性才能产生干扰。在这些情况下，宜应用特殊程序以定量MTT“真正”的还原。参考文献[23]和[24]给出了测试可能与MTT相互作用的方案。使用特殊或适合的对照，在减去因直接化学性MTT还原和/或组织中浸提出的化学物残留颜色导致的非特异性光密度(OD)值后，能计算出真正的组织活性。
6.2.3预测模型
此预测模型是基于OECD 439预测模型和在优化医疗器械方案过程中进一步获得的数据。
如果接触后细胞活性≤50%：试验样品为刺激物(1)。
如果接触后细胞活性>50%：试验样品为非刺激物(NI)。
应对极性(如生理盐水)及非极性(如芝麻油)试验浸提液进行细胞活性试验。如果至少一种浸提液显示出阳性结果(活性≤50%)，那么认为此医疗器械样品有潜在的刺激性，然后应考虑该器械或器械组件会引起刺激反应。必要时，可考虑进行体内试验进一步评价刺激反应的类型。若两种浸提液结果均为非刺激物(活性>50%)，应认为器械或器械组件为非刺激物。
6.3材料
6.3.1重建人类表皮模型——产品说明
表皮细胞取自HIV1、2抗体，丙型肝炎抗体、乙肝抗原均阴性的健康志愿者。尽管如此，宜按照生物材料的常规处理程序。
对基于医疗器械浸提液的试验样品，在一项大型国际比对试验中评价了OECD 439中描述和验证的两种RhE模型的应用。在这个试验中使用了EpiDermTM组织EPI-2001)模型和SkinEthicTMRhE模型2)。已制定这些模型的具体方案作为补充材料。
这两个模型均已被欧洲替代方法验证中心(ECVAM)验证用于测定化学物皮肤刺激并被OECD 439和欧盟(EU)导则B.46收录。出于分类和标识的目的，这些模型已用纯工业化学物进行了验证。如果经过医疗器械浸提液皮肤和组织刺激试验验证，OECD 439中描述和验证的其他模型也能用于医疗器械体外皮肤刺激试验。
一个新的用于体外皮肤刺激性试验的RhE模型若要列入OECD 439，应证明其预测能力和实验室内及实验室间变异性与最初的比对试验有等同的表现。需对一组与最初比对试验相同的刺激及非刺激材料进行实验室间(至少3个实验室)的3轮(3个生产批号的RhE模型)盲法试验。
6.3.2医疗器械浸提液制备
应按照ISO 10993-12制备医疗器械和/或生物材料浸提液。
——极性没提液应在0.9%生理盐水中制备(900mg加入100mL超纯水或去离子水)。
——非极性浸提液应在芝麻油中制备(可接受的质量实例：超精炼和医药级)。
注1：在比对试验中证明0.9%氯化钠注射液和芝麻油是用于体外RhE刺激试验的PVC和/或硅树脂聚合物中的刺激物的适宜没提剂。因此，推荐以上浸提介质。


1) EpiDermTM是由MatTek体外生命科学实验室(布拉迪斯拉发：斯洛伐克)和MarTek公司(阿什兰，马里兰州，美国)提供的产品的商标。给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，那么可以使用这些等效产品。
2) SkinEticTMRHE是由EpiSkin SA(里昂，法国)、EpiSkin Brazil里约热内卢，巴西)和Shanghai EpiSkin Biotech-nology(上海，中国)共同提供的产品的商标。给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，那么可以使用这些等效产品。


若使用其他浸提介质进行浸提，应提供验证数据，以确认浸提介质的变化不会影响试验系统区分阴性、弱、中、强刺激物的能力。
宜基于ISO 10993-12论证浸提时间和温度。
注2：在评价RhE用于医疗器械试验液刺激试验的比对试验中，使用了加标(spiked)聚合物(PVC和硅树脂)，在(37±1)℃振荡/振摇(72±2)h进行的浸提。
不适合浸提的材料(如液体、凝胶、糊剂和颗粒)可能适用于此试验系统。如果使用，宜在测试前提供验证数据，以证明该方法检测这些材料形式的刺激活性的能力。
6.4 方法
6.4.1总则
警告——本文件描述的操作步骤要求使用危险试剂。本文件不声称涵盖所有相关的安全问题。本文件的使用者有责任采取适当的预防和职业健康与安全措施，并确保遵守法规和法规要求。
MTT具有以下危险：
——H302：吞咽有害；
——H315：引起皮肤刺激；
——H319：引起严重眼刺激；
——H330：吸入致命；
——H335：可引起呼吸道刺激；
——H341：怀疑会导致遗传性缺陷(说明接触途径——如已确证无其他接触途径造成这一危险)。
异内醇具有以下危险：
——H225：高度易燃液体和蒸气；
——H319：引起严重眼刺激；
——H336：可引起昏睡或眩晕。
6.4.2试验步骤
附录B提供了使用重建人类表皮(RhE)模型进行体外刺激试验的清单。
应记录RhE刺激试验过程中所有操作。附录C提供了方法记录单(MDS)举例。以下是进行体外皮肤刺激试验的不同步骤的描述。应遵循以下步骤，对任何偏差进行验证并提供验证数据。
——RhE组织到达前开始制备器械/生物材料试验样品的极性(生理盐水)和非极性(芝麻油)浸提液。浸提开始时间宜基于按照ISO 10993-12选择的浸提时间和组织准备好进行处理的时间(取决于RhE组织到达和必需的预培养时间)。试验材料/医疗器械浸提液宜在ISO 10993-12允许的时间范围内使用，以便将浸提液用于生物相容性试验。浸提过程中持续振荡/振摇。
——收到RhE组织后，即将RhE组织从运输板培养基转移至组织制造商要求使用的培养基中。如果组织制造商的说明中有要求，将组织放入大小合适的培养板中用培养基预培养(见6.5.2)。
——如果不包括阳性对照材料的没提，在试验当天将阳性对照(SDS)按规定的浓度注入极性(生理盐水)溶剂中。在证明适宜性和阳性结果后，能使用较低浓度的SDS(如0.25%～0.5%)作为阳性对照。
入在组织表面分别加上100μL阴性对照、阳性对照、介质对照和试验样品。
——在(37±1)℃、(5±1)% CO2的湿化培养箱中培养(18±1)h或(24±2)h。
注：比对试验中EpiDermTM组织(EPI-200)培养时间是18 h，SkinEthicTMRhE模型是24h。接触18h或24h两种模型显示了相似的试验结果
——通过DPBS或不含Ca2+、Mg2+的PBS冲洗以终止接触。冲洗后按照组织制造商说明除去组织多余水分。
——转移组织至MTT溶液(可选择：采集培养基以各白介素释放测定，≤-20℃冰箱保存样本)。
——在MTT中培养组织3h±5 min[(37±1)℃，(5±1)% CO2，湿化培养箱中]。
——转移并浸入甲臜萃取介质异丙醇中。
——甲臜萃取：室温至少2h或过夜(密封，室温)。
——振摇并混匀。
——转移甲臜溶液至96孔板。
——平板分光光度计读取OD值。
6.4.3培养基和终点溶液
6.4.3.1 MTT溶液
MTT溶液对光敏感。使用锡箔纸或适宜材料避光保护。
用PBS溶解MTT粉末至终浓度5 mg/mL。0.22 μm滤膜过滤。在无菌深色1.5mL微量管中制备即用型溶液(如1mL等分试样)。-20℃冰箱保存试剂。保存时间：-20℃下1年。
或者，也能使用RhE组织制造商制备的MTT溶液。
使用预热的培养基稀释MTT储备液至终浓度1mg/mL。使用前避光保存(使用前储存时间不超过2h)。
6.4.3.2 异丙醇溶液
使用未稀释的2-内醇原液(CAS号：67-63-0)。
6.4.4试验样品和对照制备
记录对照或试验浸提液的主要信息，包括代码或数字、物理特性(如黏稠度)、体积或质量、失效日期和储存条件。记录制备及方法细节。附录C提供了制备记录举例。
阴性对照的具体步骤(DPBS或PBS)：阴性对照为DPBS或不含Ca2+、Mg2+的PBS。应使用无菌即用型DPBS或PBS。若DPBS或PBS由10倍浓度或粉末制备需将pH调至7.0并将溶液灭菌。应将3×100μL体积分别加入3块单独的RhE组织。
阳性对照的具体步骤(1%体积分数SDS)：应将500μL 20% SDS水溶液与9.5mL特定法提介质(生理盐水)彻底混匀。制备后，用适合的加样器将100μL转移并加至RhE组织上。在证明适宜性和阳性结果后，可使用较低浓度的SDS(如0.25%～0.5%)作为阳性对照。
应在试验当天每次使用前新鲜制备极性浸提介质的阳性对照。
应使用商品化的20% SDS溶液。
介质对照的具体步骤：应将介质对照(0.9%生理盐水和芝麻油)置于浸提容器(如琥珀色玻璃瓶)并进行如在(37±1)℃、(72±2)h中与试验材料完全相同的浸提程序。如果直接将样品接触组织，这一步能省略。
阳性对照材料是很少的。日本食物及药物安全中心的Hatano研究所提供的Y-4聚合物或其他已证实的适合的供应商提供的对照(若经验证)能用于体外RhE模型试验。若经验证，硅树脂-SDS能用作生理盐水浸提液的阳性对照。
6.5试验的注意事项
6.5.1重建人表皮组织的接收
应记录试剂盒详细信息及测试过程(如记录于MDS)。
6.5.2准备及预培养
按以下步骤进行。
——如果RhE组织制造商的说明中有要求，将组织放入大小合适的培养板中用组织制造商要求的培养基预培养。
——根据RhE组织制造商的说明将合适数量的培养孔加入适量的新鲜培养基备用。
——无菌条件下，打开盛有RhE组织的培养板的盖子。无菌气流下拿开盖子并小心(用无菌镊子)拿出每个盛有RhE组织的小室。在无菌滤纸或纱布上轻轻吸去所有黏附在小室外侧缘残留琼脂，然后将组织置于无菌的盛有新鲜培养基的孔中。
——肉眼检查确认无琼脂残留，转移组织至新鲜培养基，倾斜小室避免底部气泡形成。
注：用于运输的24孔板能在室温密封保存/储存，以便在1周后观察有无可能的污染迹象。
——检查RhE组织质量并记录组织变化。
——根据制造商的使用说明将盛有RhE组织的小室转移至预先加有培养基的培养板中。根据制造商使用要求预培养[(37±1)℃、(5±1)%CO2的湿化培养箱中]组织备用。
6.6加样和冲洗
6.6.1总则
虽然使用所有模型进行的体外皮肤刺激试验都遵循相同的原则，但宜注意在进行试验时，具体模型间可能存在小的差异。
如果标准操作程序(SOP)适用于特定RhE模型，宜遵从制造商SOP，并考虑本文件中的医疗器械浸提液试验中特殊方面(如接触时间)。在使用OECD 439引用的某一RhE模型进行医疗器械浸提液和/或医疗器械进行试验之前，应证明此特定模型的适用性，当用于医疗器械系统时，这些商业的或优化的使用说明宜产生与本文件中包含的已验证方法等效的结果。
6.6.2准备
按以下步骤进行。
——室温预热维持培养基。
——加样前约5min从培养箱中拿出预培养的培养板。
——加样前准备。
●准备合适大小的培养板用于RhE模型与试验样品和对照一起培养。
●用试验材料代码标记培养板盖子；每个样品和对照3块组织/孔。
●更换小室下的培养基(加入适量的培养其)或将小室移入含新鲜培养其的新板中。
6.6.3试验浸提液及对照的接触
按以下步骤进行。
——吸取(100±2)μL(即200μL/cm2)未稀释的样品试验液(即医疗器械浸提液)、VCs、NCs或PCs置于各自3个单独组织的表面。用移液器吸头轻轻地将样品试验液铺在RhE组织表面。因冲洗顺序要与加样顺序相同，所以加样顺序非常重要。
注1：模型表面是疏水的，所以确保100μL均匀涂布在RhE组织的整个表面。由于表面张力机制，有时极性溶剂微滴只能分布至RhE组织的外缘。这种情况下，能使用移液器吸头铺开样品或使用镊子敲击小室使样品覆盖整个RhE组织的表面。另外，对于油性浸提液，能使用头端球状的玻璃移液器(Pastcur)铺开试验样品以保证其与整个RhE组织的表面的正确接触。
——加样后的组织放在层流净化罩内，直至最后一块组织加样完成。
——所有组织加样完成后，转移所有培养板至湿化培养箱[(37±1)℃、(5±1% CO2]培养至所需时间。
注2：比对试验中EpiDermTM华组织(EPI-200)培养时间是(18±1)h，SkinEthicTMRhE模型是(24±2)h。
——接触完成后，使用灭菌DPBS或PBS彻底冲洗组织，加满再清空小室数次以去除残留试验材料，推荐冲洗15次～25次。若RhE模型制造商提供具体说明则遵照执行。冲洗不宜太轻柔，否则试验样品不能完全清除。
——冲洗后，反扣小室轻轻振动去掉残留DPBS或PBS，在无菌吸水纸上反扣小室排干水分。
——将组织表面吸干(如使用双头棉签)。
——转移小室至适宜容器或预先加有新鲜测试培养基的(0.3 mL/孔)组织培养板中，直至冲洗完所有组织、准备进行MTT培养。
若发现试验样品仍有残存在RhE组织表面的迹象，试着使用无菌湿棉棒去除。记录该过程。可在解剖镜下肉眼评价组织表面。
注 3：评价RhE组织活性前能收集小室下培养基进行额外的细胞因子测定，存活组织的减少公伴随IL-1α的释放。
6.7用于测定接触阶段后RhE组织活性的MTT试验
6.7.1MTT 培养和异丙醇萃取
通过MTT 还原测定法评估RhE组织活性。接触结束后立即进行MTT测试。冲洗组织去除残留试验样品。
应在开始冲洗步骤前准备MTT溶液并提前加入24孔培养板中(300μL/孔)。
——准备MTT 培养其和加有测试培养基的24孔板或其他合适的培养板。将300μL MTT 培养基(浓度为1mg/mL)加入所需数量的24孔板的各孔中。
——从临时存储板中移出小室，按在无菌吸水纸或使用无菌棉签弄干小室底部，然后转移至预先加入300 μL MTT的24孔板中。将培养板放入培养箱[(37±1)℃、(5±1)% CO2的湿化培养箱中]，在记录单(如在MDS中)上记录MTT培养开始时间，培养3h±5 min。
——MTT培养完成后，吸干小室中所有残留MTT溶液，根据RhE供应商说明书转移组织至合适的盛有适量异内醇的组织培养板中。
——密封容器或平板，或置于密封塑料袋中防止蒸发。记录萃取开始时间(如在MDS中)，用平板振荡器以约120r/min的速率室温轻轻振荡萃取甲臜至少2h。也可选择过夜萃取(18h～24h)，上述密封平板不振荡条件下室温或冰箱内避光萃取。分析萃取液前，在平板振荡器振荡至少15 min。
——培养后，使用枪头成20G注射针刺破组织和膜以得到相应孔中的所有萃取液。得到溶有甲臜的溶液测吸光度。转移萃取液至96孔板前用加样器至少上下吹打3次至溶液均匀。