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This document was proposed by the National Medical Products Administration of People's Republic of China.
This document is under the jurisdiction of the National Technical Committee on Biological Evaluation on Medical Device of Standardization Administration of China (SAC/TC 248).
Introduction
The normal keratinocytes obtained from healthy volunteers may be cultured at the gas-liquid interface on the film or filter paper for several days to form a three-dimensional skin model, including the basal layer, stratum spinosum, granular layer and functional stratum corneum, that is, the reconstructed human epidermis model. This model was originally developed to detect outer skin irritation of pure chemical objects. In recent years, such models have also been used to detect stimulating substance in medical devices.
In vitro skin irritation test for medical devices
1 Scope
This document specifies a method for test for medical devices using a reconstructed human epidermis (RhE) model.
This document is applicable to in vitro skin irritation test using RhE model to evaluate the potential skin irritation of medical devices.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
GB/T 16886.10 Biological evaluation of medical devices — Part 10: Tests for irritation and skin sensitization
GB/T 16886.12 Biological evaluation of medical devices — Part 12: Sample preparation and reference materials
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in GB/T 16886.10 and GB/T 16886.12 apply.
4 Test principle
The polar and non-polar extracts of medical devices/materials or the devices/materials themselves may directly contact the upper surface of the RhE model; wash and remove the test samples on the epidermis after incubation for a certain time, and then detect the cell activity of the RhE model by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) test; compare with the negative control to obtain the tissue activity, and predict the irritation of the test samples according to the tissue activity.
5 Material
5.1 RhE model
The commercial RhE model is used for the test. See Annex A for instructions of RhE model.
Epidermal cells shall be taken from healthy volunteers whose antigens are negative for human immunodeficiency virus (HIV) 1 and 2 antibodies, HCV-Ab, hepatitis B. Users of this document should establish corresponding safety and health regulations to ensure biosafety.
5.2 Instruments and apparatus
Instruments and apparatus are as follows:
a) bechtop;
b) biosafety cabinet;
c) cell incubator;
d) balance;
e) microplate reader;
f) horizontal shaking table;
g) vortex oscillator;
h) pipettor (200 μL, 1 mL), piston displacement pipettor (100 μL), continuous liquid separator;
i) timer.
5.3 Reagent consumables
Reagent consumables are as follows:
a) skin model culture medium (provided by the skin model manufacturer and used together with the skin model);
b) Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS, 1 ×);
c) sodium chloride injection (mass concentration: 0.9%);
d) sesame oil (high purity or medicinal grade);
e) MTT;
f) sodium dodecyl sulfate (SDS, mass concentration: 20%);
g) isopropanol (analytically pure);
h) 6-well culture plate, 24-well culture plate and 96-well culture plate (flat bottom).
i) aseptic centrifuge tube;
j) flushing liquid collection bottle;
k) angled blunt nose tweezers;
l) large funnel;
m) sealing film;
n) tin foil;
o) sterile cotton swab.
6 Test procedure
6.1 Preparation of extract and control solution
6.1.1 Preparation of extract
The extracts of medical devices and/or materials shall be prepared according to GB/T 16886.12, and attention shall be paid to aseptic operation.
0.9% sodium chloride injection should be used as polar extraction vehicle to prepare polar extraction solution, and sesame oil should be used as non-polar extraction vehicle to prepare non-polar extraction solution. If other extraction vehicle is used, it shall be proved that the extraction vehicle will not affect the test system.
The extraction time and temperature should be demonstrated based on GB/T 16886.12.
When testing medical devices and/or materials that are not suitable for extraction, their suitability should be demonstrated.
6.1.2 Preparation of control solution
6.1.2.1 Negative control
Sterile DPBS (1 ×).
6.1.2.2 Vehicle control
The vehicle control shall be placed in the extraction container, and the same extraction procedure as the medical device and/or material shall be carried out.
6.1.2.3 Positive control
1% SDS solution. Take 0.5 mL of 20% SDS aqueous solution and 9.5 mL of corresponding extraction vehicle, and mix well with vortex oscillator.
Note 1: The positive control prepared freshly on the day of test is used, and it is recommended to use 20% commercial SDS solution to prepare positive control. SDS positive control may be prepared by sterile DPBS when the test samples are not suitable for extraction.
Note 2: If the test sample reacts with MTT reagent, or the tissues or cells are stained; and there is still a certain amount of residue after washing, the test results may be disturbed.
In this case, an appropriate control may be set to eliminate interference.
Foreword i
Introduction ii
1 Scope
2 Normative references
3 Terms and definitions
4 Test principle
5 Material
6 Test procedure
7 Data calculation steps
8 Acceptance criteria for test
9 Result judgment
10 Test report
Annex A (Informative) Description of the RhE model
Bibliography
ICS 11.040.01
CCS C 30
YY
中华人民共和国医药行业标准
YY／T 1808—2021
医疗器械体外皮肤刺激试验
In vitro skin irritation test for medical devices
2021-09-06发布 2022-09-01实施
国家药品监督管理局 发布
前言
本文件按照GB／T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由国家药品监督管理局提出。
本文件由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会(SAC／TC 248)归口。
引言
将从健康志愿者获取的正常角蛋白细胞在薄膜或滤纸上的气液交界面培养数日后可形成包括基底层、棘层、颗粒层和有功能的角质层在内的三维皮肤模型，即重建人表皮模型。此模型起初是为检测纯化学物体外皮肤刺激性而研发的。近年来，此类模型也被用于检测医疗器械中的刺激性物质。
医疗器械体外皮肤刺激试验
1 范围
本文件规定了采用重建人表皮(RhE)模型进行医疗器械体外皮肤刺激试验的方法。
本文件适用于采用RhE模型进行体外皮肤刺激试验评价医疗器械潜在的皮肤刺激性。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB／T 16886.10 医疗器械生物学评价 第10部分：刺激与皮肤致敏试验
GB／T 16886.12 医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与参照材料
3 术语和定义
GB／T 16886.10和GB／T 16886.12界定的术语和定义适用于本文件。
4 试验原理
医疗器械／材料的极性和非极性浸提液或器械／材料本身可直接接触RhE模型的上表面，孵育一定.时间后冲洗除去表皮上的试验样品，再用四甲基偶氮唑盐(MTT)试验检测RhE模型细胞活性，与阴性对照相比得到组织活度，根据组织活度预测试验样品的刺激性。
5 材料
5.1 RhE 模型
使用商品化RhE模型进行试验。RhE模型的说明见附录A。
表皮细胞应取自人类免疫缺陷病毒(HIV)1、2抗体、丙型肝炎抗体、乙肝等抗原均阴性的健康志愿者。本文件的使用者宜建立相应的安全和健康规程以确保生物安全。
5.2 仪器设备
仪器设备如下：
a) 超净工作台。
b) 生物安全柜。
c) 细胞培养箱。
d) 天平。
e) 酶标仪。
f) 水平摇床。
g) 涡旋振荡器。
h) 移液器(200μL、1mL)、活塞排代式移液器(100μL)、连续分液器。
i) 计时器。
5.3 试剂耗材
试剂耗材如下：
a) 皮肤模型培养基(由皮肤模型制造商提供，与皮肤模型配套使用)。
b) 杜氏磷酸缓冲盐溶液(DPBS，1×)。
c) 氯化钠注射液(质量浓度：0.9％)。
d) 芝麻油(高纯度或药用级)。
e) MTT。
f) 十二烷基硫酸钠(SDS，质量浓度：20％)。
g) 异丙醇(分析纯)。
h) 6孔培养板、24孔培养板、96孔培养板(平底)。
i) 无菌离心管。
j) 冲洗液收集瓶。
k) 弯头钝头镊子。
l) 大漏斗。
m) 封口膜。
n) 锡箔纸。
o) 无菌棉棒。
6 试验步骤
6.1 浸提液及对照液的制备
6.1.1 浸提液的制备
应按照GB／T 16886.12制备医疗器械和／或材料浸提液，注意无菌操作。
宜使用0.9％氯化钠注射液作为极性浸提介质制备极性浸提液，宜使用芝麻油作为非极性浸提介质制备非极性浸提液。若使用其他浸提介质，应证明浸提介质不影响试验系统。
宜基于GB／T 16886.12论证浸提时间和温度。
不适合浸提的医疗器械和／或材料进行试验时，宜论证其适用性。
6.1.2 对照液的制备
6.1.2.1 阴性对照
无菌DPBS(1×)。
6.1.2.2 介质对照
应将介质对照置于浸提容器中并进行与医疗器械和／或材料相同的浸提程序。
6.1.2.3 阳性对照
1％的SDS溶液。取0.5mL 20％SDS水溶液与9.5mL相应浸提介质，用漩涡振荡器充分混匀。
注1：使用试验当天新鲜制备的阳性对照，推荐使用商品化20％SDS溶液制备阳性对照。对不适合浸提的试验样品进行试验时，可用无菌DPBS制备SDS阳性对照。
注2：若试验样品与MTT试剂反应，或将组织或细胞染色且在冲洗后仍有一定量的残留，试验结果可能会被干扰。
在这种情况下，可设置适宜的对照以消除干扰。
6.2 RhE 模型的准备及预孵育
接收皮肤组织后，根据模型制造商的说明将模型放入大小合适的培养板(如6孔培养板)中，用配套的培养基预孵育。根据制造商的说明将适量培养基加入培养板中。无菌条件下，打开盛有RhE模型的培养板盖子。用镊子小心拿出盛有皮肤组织的小室，在无菌纱布或滤纸上轻轻除去粘附在小室外侧缘的残留琼脂。检查确认无残留后将模型转移至新鲜培养基，倾斜小室避免底部产生气泡。根据制造商说明书预孵育皮肤模型。
注：保存运送组织的琼脂培养板室温下密封数日能观察有无污染迹象。
6.3 加样和冲洗
6.3.1 总则
虽然采用不同模型进行的体外皮肤刺激试验都遵循相同原则，但不同模型的具体操作可能存在差异。接触时间等条件宜遵从制造商说明书的规定。
6.3.2 准备
室温预热培养基。加样前约5min从培养箱中拿出预孵育的培养板。加样前准备大小合适的培养板(根据制造商的要求选择)用于RhE模型与样品及对照的孵育。用代码标记培养板盖子，每个试验样品(如样品1的两种浸提液可记为T1-1和T1-2)、阳性对照(可记为PC1和PC2)、介质对照(可记为VC1和VC2)和阴性对照(可记为NC)分别使用3块组织。更换小室下的培养基或将小室移入含新鲜培养基的培养板中。检查培养板底部以确认转移过程中无气泡产生。
6.3.3 加样
分别吸取100μL未稀释的试验样品、VC、NC或PC置于每个表皮表面(平行3孔，注意使用活塞排代式移液器吸取黏稠液体)。用枪头轻轻将液体铺在皮肤上表面。加样完成后，转移培养板至培养箱(37℃±1℃，5％CO2±1％CO2，相对湿度95％)孵育至制造商规定时间。
注1：记住加样顺序，因冲洗顺序要与加样顺序一致。
注2：因模型表面是疏水的，所以要确保100μL溶液均匀涂布在表皮的整个表面。在表面张力作用下，有时极性溶剂微滴只能分布到表皮的外缘。这种情况下，可使用枪头铺开样品或使用镊子敲击小室使样品覆盖整个表皮。另外，对于油性浸提液或1％ SDS芝麻油乳浊液，可使用头端球状的玻璃器具或移液器吸头铺开液体以保证其与整个表皮完全接触。
6.3.4 冲洗
孵育后，使用连续分液器吸取灭菌DPBS彻底冲洗组织，推荐冲洗15～25次以去除残留试验材料，根据组织制造商提供的具体说明进行。冲洗不能太轻柔，否则试验样品不能完全清除，可使用大漏斗和塑料瓶收集冲洗液，注意防止飞溅和污染。冲洗后，在无菌吸水纸上反扣小室排干水分。使用棉签轻轻拭干表皮表面，并用吸水纸或棉签拭干小室底部。转移小室至预先加有新鲜培养基(0.3mL／孔)的24孔板中临时存储，准备进行MTT孵育。若发现皮肤表面仍有残存试验样品，使用无菌棉棒去除并记录。
6.4 RhE模型MTT孵育及吸光度测定
6.4.1 MTT孵育
6.4.1.1 MTT母液配制
将MTT粉末溶解于DPBS中，质量浓度为5mg／mL。MTT充分溶解后，使用0.22μm滤膜过滤，用锡箔纸包裹避光－20℃保存，可保存1年。
6.4.1.2 MTT工作液配制
用室温预热的培养基将MTT母液稀释至1mg／mL。
注：MTT工作液要现配现用。
6.4.1.3 转移及孵育
从临时存储板中移出小室，使用无菌吸水纸或无菌棉签拭干小室底部，然后将其转移至预先加入0.3mL MTT工作液的24孔板中，使用锡箔纸包裹避光。将培养板放入培养箱(37℃±1℃，5％CO2±1％CO2，相对湿度95％)孵育180min±5min。
6.4.1.4 萃取
MTT孵育完成后，拭干小室内外所有残留MTT溶液，根据组织制造商说明转移组织至合适的盛有适量异丙醇的组织培养板中。使用封口膜密封容器或培养板防止液体挥发。记录开始时间，用培养板振荡器(120r／min)室温振荡至少120min±5min。使用枪头或注射针刺破组织得到相应孔中的萃取液。用加样器至少混匀3次至溶液均匀后转移至96孔板。
注：上述密封平板在不振荡条件下可在室温或冰箱内避光过夜萃取(18 h~24 h).收集萃取液前使用振荡器振荡平板至少15min。
6.4.2 吸光度测定
根据模型制造商说明从每个试验孔中转移200μL液体至平底96孔培养板中(适当标记)，平行3孔。使用酶标仪根据制造商说明在合适的波长下测定吸光度(OD)值，通常使用570nm波长。异丙醇溶液作为空白对照，平行6孔。
注：及时测量，避免96孔板中异丙醇蒸发。
7 数据计算步骤
以下计算步骤适用于不与MTT试剂反应、无色、不会将组织染色、非特异性OD值小于或等于阴性对照的5％的试验样品。
a) 空白对照：计算6个空白对照孔的平均OD值作为空白对照组OD值。
b) NC：NC组每块组织3个复孔的OD值均减去空白对照OD值后再相加求和，其和除以3得NC组每块组织的OD值，然后计算NC组3块组织OD值的平均值作为NC组OD值。
c) PC： 同法计算PC组每块组织的OD值。用下式计算PC组每块组织的组织活度：
式中：
VD——组织活度，％；
ODx——PC、VC或试验样品组每块组织的OD值；
ODNC——NC组OD值。
然后计算PC组3块组织的组织活度的平均值作为PC组的组织活度。
d) 同法计算试验样品和VC组每块组织的组织活度，然后计算各组3块组织平均组织活度作为各组的组织活度。
e) 根据各组每块组织的组织活度计算各组3块组织的组织活度的标准差(SD)。
注：若为排除试验样品干扰设置了相应对照，则在计算结果时扣除非特异性OD值。
8 试验接受准则
8.1 NC和VC接受准则
a) NC或VC的3块组织OD570平均值大于或等于0.7且小于3.0，则NC或VC的组织活度通常符合接受准则。
注：0.7和3.0是经济合作与发展组织化学品试验导则439(OECD TG439)中几种RhE模型NC和VC的最小和最大OD值，每种模型组织的范围可能有所差异。
b) 除了符合a)外，每种模型NC和VC的OD值范围应符合制造商各自的接受准则。
c) 孵育后NC或VC3块组织的组织活度的SD小于或等于20％。
d) VC组的组织活度应为NC的80％～120％。
8.2 PC接受准则
孵育后PC组的组织活度为NC的40％以下且3块组织的组织活度的SD小于或等于20％，则PC数据符合接受准则。
8.3 试验样品数据接受准则
试验样品孵育后3块组织的组织活度的SD小于或等于20％，则认为数据有效。若不符合要求则应重复试验。
9 结果判定
根据试验样品组的组织活度预测试验样品潜在刺激性。组织活度小于或等于阴性对照的50％即表示出现刺激反应。试验组至少一个浸提液组的组织活度小于或等于50％，则认为此医疗器械／材料有皮肤刺激性，见表1。
表1 皮肤刺激结果的判定
试验结果 判定
至少一个浸提液组的组织活度小于或等于阴性对照的50％ 刺激性(I)
两个浸提液组的组织活度均大于阴性对照的50％ 非刺激性(NI)
10 试验报告
试验报告应至少包括以下信息：
——试验材料或器械的描述；
——RhE模型的描述及其质控证书复印件；
——试验方法，包括样品制备过程的详细描述；
——试验结果；
——试验结论。
附录A
(资料性)
RhE模型的说明
OECD TG 439中收录了已经经过验证的6种RhE模型：EpiSkinTM (SM)、EpiDermTM SIT(EPI-200)、SkinEthicTM RHE、LabCyte EPI-MODEL24 SIT、epiCS和Skin＋。另外，文件中还提供了模型验证方案与接受准则。其他模型若能通过对6种RhE模型比对试验相同的刺激及非刺激材料进行的实验室间(至少3个实验室)3轮(3个生产批号的RhE模型)盲法验证试验，证明其预测能力、实验室内及实验室间变异性与已收录某种模型有等同的表现，则可证明其与已收录模型的等效性。
ISO／TC 194相关工作组采用以上6种模型中的EpiDermTM (EPI-200)和SkinEthicTM RHE两种模型对医疗器械体外皮肤刺激试验进行了国际实验室间比对，验证了这两种模型的有效性。
其他模型如果通过了以上两种形式的比对试验即追随验证试验(catch-up validation)，则认为可用于医疗器械体外皮肤刺激试验。
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